猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是一种猪的高度传染性病毒疾病,其主要特征为呕吐、厌食、水样腹泻、脱水和体重减轻。各个年龄段的猪对该病均易感,其中新生仔猪的病死率最高可达100%,严重危害我国的养猪业。猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的基因组全长约28 kb,从5’-3’依次为:5’非编码区、ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M、N、3’非编码区。其中,ORF1a和ORF1b在翻译后经过自剪切会生成16个非结构蛋白Nsp1～Nsp16。目前,对于PEDV的E蛋白和非结构蛋白的研究较少,其功能尚不是很清楚。本研究将针对E蛋白在PEDV复制中的必要性展开研究,同时鉴定几种非结构蛋白在受PEDV感染细胞中的表达时间和细胞内定位。具体研究如下:1.在PEDV感染Vero细胞后的3h、6h、9h、12h和24h,分别以抗Nsp2、Nsp3-Ac、Nsp5多抗为一抗进行IFA,分析几种非结构蛋白在感染细胞中的表达时间和细胞内定位。结果表明这几种非结构蛋白均在PEDV感染的早期表达,尤其是Nsp2在3 hp.i.即可用抗体检测到;而它们的特异性荧光则均以荧光焦点的形式聚集在核周或分散在细胞质中,呈现出与内质网或小囊泡相似的离散小结构。2.通过原核表达系统和真核表达系统分别表达了带有不同标签的E蛋白,但利用昆虫细胞真核表达的E蛋白无法从Ni-NTA Resin上洗脱下来,只成功纯化出了通过原核表达系统表达的E蛋白。同时,根据E蛋白的结构和免疫原性设计并合成了E的多肽。将纯化的E蛋白和E多肽分别免疫新西兰大白兔,获得两种多克隆抗体。但间接免疫荧光（IFA）和Western Blot实验结果表明,两种抗体均只能识别其免疫抗原,无法识别PEDV的天然E蛋白和细胞过表达的E蛋白。3.构建包含全长E基因的重组表达质粒pWPI-E,将其与慢病毒囊膜质粒pMD2.G、慢病毒包装质粒psPAX2共转染293T细胞包装重组慢病毒。通过将重组慢病毒感染靶细胞及药物筛选,成功制备了稳定表达E蛋白的BHK-E和Vero-E细胞系,并通过Real-time PCR对细胞系E蛋白的表达量进行了相对定量。4.通过体外同源重组方法构建了包含点突变（位于转录调控序列和起始密码子）并缺失大部分E基因序列的PEDV全长感染性克隆pSB2μ-PEDV-△E,以及缺失全部nsp2基因的PEDV全长克隆pSB2μ-PEDV-△nsp2。使用感染性克隆pSB2μ-PEDV-△E拯救重组病毒rPEDV-ΔE,结果表明只有在稳定表达E蛋白的BHK-E和Vero-E细胞中才能拯救rPEDV-ΔE并传代,证明E蛋白在PEDV的复制中是不可或缺的。综上所述,本研究表明E蛋白对于PEDV的复制是必需的。同时证明了 Nsp2、Nsp3-Ac、Nsp5蛋白均在PEDV感染的早期表达,并具有相似细胞内定位。本研究为进一步探索E蛋白和Nsp蛋白的功能奠定了基础。同时,本研究中的缺失E蛋白的重组病毒可发展为安全的新型疫苗,抗Nsp2的抗体可用作PEDV感染早期的诊断工具,对流行的G2亚型PEDV的诊断与预防有重要意义。