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研究背景及研究目的:鼻咽癌是一种起源于鼻咽上皮并好发于广东地区的恶性肿瘤,EBV感染是鼻咽癌发生、发展过程中的重要病原学因素。EBNA1是EBV编码的核抗原,在EBV基因组的维持、复制、有丝分裂后的EBV基因组分离等方面起着关键作用。EBNA1在所有EBV相关性疾病中均表达,为宿主细胞提供生存能力。然而,EBNA1抗原蛋白在鼻咽癌构建免疫抑制微环境中发挥何种作用?Treg细胞是限制抗肿瘤免疫反应的重要因素,然而Treg细胞是如何募集到鼻咽癌微环境中构建抑制性免疫微环境的机制尚不明确,本课题将就此切入点进行深入探讨。研究方法及研究内容:原位杂交(ISH)检测组织EBER以明确EBV感染;二代测序(NGS)及生物信息学分析筛选EBNA1过表达前后的差异表达基因;qRT-PCR、WB、IHC、transwe11、流式细胞术、裸鼠成瘤实验在体内、体外及患者组织水平验证EBV-EBNA1-TGFβ 1-SMAD3-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12-CXCR4 反馈环路调控Treg细胞向鼻咽癌微环境趋向性迁移;共聚焦共定位分析和Co-IP实验验证SMAD3和c-JUN形成蛋白复合体介导TGF β1信号;ChIP实验和双荧光素酶报告实验验证c-JUN作用于miR-200a启动子;双荧光素酶报告实验还用于验证miR-200a靶向CXCL12 3’UTR;肝癌裸鼠成瘤实验及C57BL/6小鼠成瘤实验验证CXCL12-CXCR4-Treg轴构建抑制性免疫微环境的作用在实体瘤中具有普遍适用性。研究结果:1、EBNA1表达水平与鼻咽癌Treg细胞浸润密度呈正相关关系;EBNA1高表达是鼻咽癌构建免疫抑制微环境和预后不良的重要预测指标。2、EBNA1通过激活TGF β 1-SMAD3通路促进Treg细胞向鼻咽癌微环境迁移。3、EBV-EBNA1-TGF β 1-SMAD3轴通过抑制miR-200a来募集Treg细胞构建鼻咽癌免疫抑制微环境。4、miR-200a直接靶向调控CXCL12 3’UTR区域,并与CXCL12形成CXCL12-miR-200a-CXCL12负性反馈调控环路,共同调节Treg细胞趋向性迁移。5、c-JUN直接靶向抑制miR-200a启动子区域并与CXCL12互为正性调控。EBNA1通过 CXCL12-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12反馈调控环路调节 Treg 细胞募集,构建以Treg细胞介导的免疫抑制微环境。6、TGFβ 1通过促进c-JUN表达及增强SMAD3/c-JUN蛋白-蛋白复合体的相互作用程度来抑制miR-200a转录。7、TGF β 1以miR-200a依赖性方式正性调控CXCL12表达及由CXCL12介导的Treg细胞趋向性迁移。8、CXCL12通过上调Treg细胞的CXCR4受体来招募Treg向鼻咽癌微环境富集,且CXCL12-CXCR4-Treg轴在实体瘤免疫抑制微环境的构建中具有普遍适用性。研究结论:EB病毒EBNA1 抗原蛋白通过上调鼻咽癌细胞内部的TGF β1-SMAD3-PI3K-AKT-c-JUN-CXCL12 信号轴及抑制 miR-200a 表达,并诱导 Treg 细胞表面的CXCR4受体表达上调,增强由CXCL12-CXCR4配体受体调控轴介导的趋化作用,从而促进Treg细胞向鼻咽癌微环境迁移,形成了 EBV-EBNA1-TGFβ1-SMAD3-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12-CXCR4-Treg 这种病毒—肿瘤-免疫三位一体的反馈调控机制,构建以Treg细胞介导的免疫抑制微环境,促进鼻咽癌免疫逃逸。本研究创新性:我们发现并证明了 EB病毒如何建立病毒-肿瘤-免疫三位一体的反馈调控机制为鼻咽癌创造免疫抑制微环境,促进鼻咽癌免疫逃逸。