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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是有包膜的正链RNA病毒,全球约1.7亿人口感染HCV,我国的感染人数高达3000-6000万。HCV感染后导致急性和慢性肝炎,约20%发展为肝硬化,并与肝癌的发生密切相关。HCV只能感染人和黑猩猩等灵长类动物,目前缺乏合适的动物模型和稳定的细胞培养系统,所以对病毒生活周期、致病机制及新的抗病毒治疗方案的评价等进展缓慢。 小鼠作为经典的实验动物模型具有许多优点,包括价格低廉、饲养方便、繁殖快、易获得等,是建立HCV感染的小动物模型的重要对象,因此人们为了建立HCV感染的小鼠模型进行了许多方面的尝试,包括将正常的人肝细胞移植到严重免疫缺陷的小鼠肝脏或无胸腺裸鼠等,得到的嵌合小鼠可以感染HCV,但是HCV的复制仅限于移植的人的肝脏细胞,HCV在小鼠肝细胞中不能复制的问题并没有得到解决。 在HCV感染机制中的研究发现HCV是由多个受体介导进入靶细胞的,这些受体主要包括低密度脂蛋白受体(LDLR)、CD81、粘多糖(GAGs)、清道夫受体B类Ⅰ型(SR-BI)。细胞的内环境也影响着病毒的感染和复制,如浸入诱导蛋白样因子(Sip-L),可以使HCV在非易感细胞中复制。 小鼠、小鼠肝细胞或小鼠肝癌细胞都不能感染HCV。小鼠和人的HCV感染分子的差异是否是造成小鼠肝细胞不能感染HCV的主要原因?当转入HCV受体基因,使其稳定表达受体分子后,是否可以感染HCV?基于以上构思我们进行了以下工作。 一、人LDLR分子真核表达载体的构建从能感染HCV的人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,逆转录得到cDNA,然后用人LDLR(hLDLR)基因的特异引物分两段进行PCR扩增,得到基因片段hLDLR1和hLDLR2。将目的基因hLDLR1和hLDLR2分别经硕士学位论文:丙型肝炎病毒感染的小鼠肝癌细胞模型研究用Hind 11工、Bgl 22和Bgl 21、xbaz双酶切后回收酶切片段,将两片段共同插入真核表达载体PcDNA3的Hind工H和Xba工酶切位点之间,构建成含全长hLDLR基因的真核表达载体。选择含正确hLDLR基因序列的表达载体转染小鼠肝癌细胞。 二、转染细胞阳性克隆的筛选及鉴定将hLDLR真核表达载体pcDNA3一hLDLR和本室已构建的小鼠白蛋白启动子调控的人cD81(hCD81)和人5 ip一L(hSip一L)的真核表达载体peDNA3一AlbEP一hCD81、pCDNA3一AlbEP一hsip一L分别转染小鼠肝癌细胞系Hep砚一6。G418加压筛选后,分别在mRNA和蛋白质水平上检测到稳定表达hCDSI分子的阳性细胞克隆。由于缺乏hLDLR和hsip一L的单克隆抗体,表达hLDLR和hs主p一L的阳性细胞克隆只是在mRNA水平上做了鉴定。 三、HCV感染转基因小鼠肝癌细胞模型的初步建立用含 10% HCV阳性血清的培养基与稳定表达目的分子的小鼠肝癌细胞H即a1一6在37℃共孵育24h,在感染后的第1、3、5、7天分别用套式RT一PCR和间接免疫荧光方法进行HCV RNA和蛋白水平上的检测。RNA检测显示在稳定表达hLDLR分子的小鼠肝癌细胞中,第l、3、5天检测到正链,第5天检测到复制中间体负链的存在;在稳定表达hCD81分子的小鼠肝癌细胞中,第1、3、5天检测到正链,第3、5天检测到负链的存在;在稳定表达hsip一L分子的小鼠肝癌细胞中,只有第1天检测到正链的存在;三种细胞在第7天均未检测到正、负链。蛋白检测显示在各种细胞中第1天均未检测到病毒蛋白;在稳定表达hLDLR分子和hCD81分子的H即a1一6细胞中,第3、5天检测到病毒蛋白:在稳定表达hs ip一L分子的Hepa卜6细胞和对照中,未检测到病毒蛋白。以上结果说明,小鼠肝癌细胞Hepal一6表面存在HCV非特异结合受体,能短暂的与HCV结合。hLDLR和hCD81等HCV受体分子在小鼠肝癌细胞的表达,不但能使HCV与小鼠肝癌细胞Hepal一6特异性结合,而且启动小鼠肝癌细胞Hepal一6对HCV的内吞作用,使病毒进入细胞并且复制。 本研究证明hLDLR和hCD81等受体导入小鼠肝癌细胞Hepal一6能使HCV感染小鼠肝癌细胞,初步建立了HCV感染的小鼠肝癌细胞模型,为进一步建立HCV转基因小鼠模型和筛选抗HCV药物及疫苗评价奠定了基础。