背景:前列腺癌居男性癌症发病率的第二位,也是全世界男性五大主要的死亡原因之一。激素抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)预后差,治疗方式主要包括:内分泌治疗、Sipuleucel T、化疗、镭223等,但患者很难持久获益,尚没有治愈的方法,急需更有效的治疗措施。肿瘤的免疫治疗近些年取得了巨大的进步,作用于PD-1/PD-L1途径的免疫检查点抑制剂疗效确切,在晚期肿瘤患者的治疗中取得了空前的成功,但在激素抵抗性前列腺癌的临床试验中尚未取得满意的治疗效果,这可能与前列腺癌的肿瘤微环境阻止T细胞浸润,肿瘤组织中缺乏细胞毒性T细胞有关。而某些化疗药物可以诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD),从而有效的增加肿瘤组织中淋巴细胞的数量和细胞毒性CD8~+T细胞的比例。故ICD与PD-1抑制剂结合有可能通过增强适应性免疫反应,改变肿瘤免疫微环境,增加T细胞活化、浸润,从而将非免疫原性肿瘤(例如CRPC)转变为免疫应答性肿瘤,促进抗癌免疫反应,这将有利于免疫系统产生持久的效应,延长激素抵抗性前列腺癌患者的生存期。第一部分Piperlongumine通过激活ROS--ER stress通路诱导前列腺癌细胞凋亡目的:通过细胞实验明确Piperlongumine(PL)对前列腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法:1.将不同浓度的PL(100--3μM)分别作用于人前列腺癌细胞系PC3、DU145以及小鼠前列腺癌细胞系RM-1,利用MTT以及克隆形成实验检测药物对前列腺癌细胞生长以及克隆形成的抑制作用,通过流式细胞术、荧光探针以及Western Blot的方法,检测PL诱导前列腺癌细胞凋亡的能力及途径。2.通过荧光探针以及流式细胞术检测PL作用后细胞内ROS含量、Caspase 3凋亡分子表达,Western Blot检测cleaved caspase 3蛋白表达;再利用ROS抑制剂NAC预处理前列腺癌细胞,检测细胞凋亡水平的变化,明确ROS在PL诱导前列腺癌细胞凋亡中的作用。3.Western Blot检测经PL诱导的前列腺癌细胞中p-EIF2α、ATF4、chop蛋白的表达量差异;chop siRNA或者NAC提前预处理前列腺癌细胞,再经PL作用,使用流式细胞术、Western Blot以及荧光探针检测前列腺癌细胞凋亡的变化,利用Western Blot分析p-EIF2α、ATF4、chop蛋白的表达差异,明确在PL作用下ROS与内质网应激、凋亡之间的关系。结果:1.PL主要通过剂量依赖的方式抑制不同种类前列腺癌细胞PC3、DU145和RM-1的增殖以及克隆形成。PL通过细胞凋亡的途径抑制前列腺细胞的生长,并且也随着剂量的增加而上调前列腺癌细胞的凋亡比例。2.PL可以增加细胞内活性氧的含量,NAC可以抑制PL诱导细胞凋亡的效果,说明PL主要通过ROS通路而诱导细胞凋亡。3.PL可以通过EIF2α--ATF4--chop通路诱导前列腺癌细胞产生内质网应激而导致细胞凋亡,且可以被chop siRNA或者NAC抑制。证明PL通过ROS-ER stress通路调解细胞凋亡。结论:PL主要通过诱导前列腺癌细胞发生氧化应激从而激活ER-stress通路,并通过上调chop蛋白的表达而引起细胞凋亡。第二部分PL增强PD-1抑制剂抗癌效果的机制研究目的:通过体外以及体内实验探索PL引起细胞免疫原性死亡的机制,在前列腺癌体内实验中评估PL是否可以改善PD-1抑制剂的抗癌效果。方法:1.在体外实验中使用不同浓度的PL作用于三种前列腺癌细胞系(DU145,PC3,RM-1),利用流式细胞术检测细胞表面钙网蛋白的表达情况,通过荧光探针检测细胞外液中ATP含量,以及使用ELISA的方法检测细胞外液中HMGB1的变化,明确细胞免疫原性死亡分子的表达。利用NAC或者chop siRNA抑制活性氧以及内质网应激凋亡通路,再观察PL对于前列腺癌细胞PC3的作用,检测钙网蛋白、ATP以及HMGB1的表达,观察PL作用下ROS-ER stress通路对前列腺癌细胞的免疫原性死亡的影响。2.鼠源性前列腺癌细胞RM-1用于评估PL在动物免疫疫苗实验中的作用。将21只C57BL/6小鼠分为三个组,每个组7只:(1)经PL处理的疫苗组;(2)经5-fu处理的疫苗组;(3)PBS组。将上述经不同处理的3X10~5 RM-1疫苗种植于准备好的C57BL/6小鼠的左侧背部,1周后活的2X10~6个RM-1细胞种植于C57BL/6小鼠的右侧背部。每3天使用卡尺测量一次右侧肿瘤大小。当肿瘤的体积达到2000mm~3时处死小鼠,统计肿瘤体积及生存期。3.PL体内治疗实验:将小鼠前列腺癌肿瘤细胞RM-1分别接种于6--8周的雄性野生型C57BL/6小鼠和NSG小鼠的背部,14天后待肿瘤直径达到50 mm~3时,将12只C57BL/6小鼠随机分为2个组:(1)PL治疗组;(2)PBS组;每组6只。(3)6只NSG小鼠经PL治疗。给予治疗后当小鼠肿瘤直径达到2000mm~3时,统一处死所有小鼠。流式细胞术、免疫组织荧光检测C57BL/6小鼠的肿瘤组织,脾脏中CD4、CD8、DC、巨噬细胞等淋巴细胞的比例变化。并统计肿瘤体积差异。4.PL联合PD-1抑制剂抗前列腺肿瘤生长的研究。RM-1肿瘤接种14天后,将20只野生型C57BL/6小鼠随机分配至以下治疗组,每组5只。(1)IgG同型对照组。腹腔注射,每周一次,共3次;(2)PL肿瘤局部注射,每周两次。共3周;(3)PD-1抗体,腹腔注射。每周一次,共3次。(4)根据上述治疗的过程,PL+PD-1抗体。常规监测肿瘤的生长,统计生存期。结果:1.PL主要通过剂量依赖的方式诱导前列腺癌细胞PC3、DU145、RM-1产生损伤相关分子模式:钙网蛋白、ATP和HMGB1,并且这种分泌主要依赖于ROS--ER stress通路。2.在动物免疫疫苗实验中发现:经过PL处理的前列腺癌细胞RM-1所得的疫苗,在免疫小鼠后,表现出良好的肿瘤控制,PL处理组肿瘤体积对比PBS组减小73%,而5-fu组比PBS组减少9%,且PL处理组肿瘤组有3/7只小鼠完全没有肿瘤生长。3.在PL体内治疗实验中发现:对比对照组,PL治疗组C57BL/6小鼠肿瘤体积缩小69%,而NSG小鼠肿瘤体积缩小了24%,且流式细胞术检测发现:在具有正常免疫系统的C57BL/6小鼠中,PL治疗组脾脏以及肿瘤组织中的CD8~+T细胞的比例比PBS组明显增加,差异显著,肿瘤组织的免疫荧光检测同样发现PL治疗组中CD8~+T细胞浸润明显增加。同时在PL治疗组脾脏和肿瘤组织中DC细胞比例对比PBS治疗组显著增加。4.在PL联合PD-1抑制剂的联合治疗中发现:单独使用PD-1抑制剂肿瘤体积较未处理组减少50%,但并未改善小鼠的生存期;而PL治疗组同样具有明显的减少肿瘤体积的作用,但仍未改善生存期。PL联合PD-1抑制剂治疗组肿瘤体积对比未处理组减少了89%,且2/5只小鼠无肿瘤存留,明显改善前列腺肿瘤的生存期,达到治愈的目的。结论:PL可以通过免疫原性死亡途径抑制前列腺癌肿瘤细胞增殖以及体内实体肿瘤的生长,并且可以有效的增强PD-1抑制剂在前列腺癌中的抗肿瘤效果,是一种有前途的治疗方式。