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原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精子和卵子的祖细胞,对物种的延续和繁衍具有重要作用,并且PGCs为发育生物学研究、移植治疗、转基因动物生产等方面提供了巨大的便利。然而,如何迅速有效地获取大量PGCs来满足研究和生产实际的需要,是突显在人们面前的问题。为此,研究者们致力于体外诱导分化为PGCs的研究,试图使得PGCs能源源不断地通过体外分化产生,但由于PGCs诱导分化效率低,诱导细胞技术体系不成熟,难以获得大量PGCs,其关键在于不完全清楚哪些因素能影响PGCs的形成,所以亟需建立健全PGCs发生的具体机制。长期以来,人们对PGCs形成的具体调控机制的研究主要局限于遗传学因素包括信号通路和关键基因的研究上,然而随着理论发展和技术手段的不断深入,研究人员更加清晰地认识到生殖干细胞发育过程是一个极其精密而复杂的调控过程,除了遗传学因素,研究者们还发现PGCs的形成离不开细胞特异性的组蛋白甲基化修饰。所以,从表观遗传修饰的角度探索组蛋白甲基化如何联系遗传学参与PGCs命运决定过程,将有助于人们更加全面地揭示PGCs的发生。为此,本研究基于本课题组前期对鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESCs)、PGCs和精原干细胞(Spermatogonial stem cel1s,SSCs)三种细胞进行的全基因组RNA-seq和H3K4me2的ChIP-seq结果,以调控PGCs形成的关键信号通路和组蛋白H3K4me2修饰为切入点,对RNA-seq筛选的候选信号通路和ChIP-seq富集的关键信号通路进行联合分析,从中筛选出参与PGCs形成的关键信号通路—Wnt信号。利用分子生物学方法探索组蛋白甲基化修饰如何协同信号通路调节PGCs形成相关基因表达进而影响PGCs形成。该研究为弄清PGCs形成的机制提供理论依据,并为后续深入研究其表观遗传调控机制奠定基础。研究结果如下:(1)H3K4me2 通过 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2 信号链调控 PGCs 形成的研究对 ESCs、PGCs和SSCs三种细胞的RNA-seq和ChIP-seq结果进行联合分析,确认PGCs发生过程中受H3K4me2调控的关键信号通路—Wnt信号通路及其关键信号分子Wnt5A、β-Catenin和TCF7L2。通过体内外实验在RNA水平和蛋白水平上验证PGCs形成过程中Wnt5a介导Wnt5a/β-Catenin/Tcf712信号链的激活,并成功构建了 Myc标记的Tcf712融合表达载体,通过免疫共沉淀实验验证了鸡β-Catenin和TCF7L2蛋白之间的互作关系,从而确定了鸡PGCs形成过程中Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链的存在,为后续探究具体调控PGCs形成的机制做铺垫。通过ChIP-qPCR在ESCs和PGCs两种细胞中验证了 H3K4me2在Wnt5A启动子区存在 2 个富集位点(P1:3.072±0.513 和 17.3±1.924；P2:2.40±0.094 和 9.97±0.625)、在β-Catenin 启动子区存在 4 个富集位点(P1:7.41±0.413 和 12.23±1.952;P2:2.23±0.155 和11.54±1.602;P3:4.19±0.516 和 7.75±0.619;P4:5.61±0.641 和 9.68±0.547)、在 TCF7L2 启动子区存在 2 个富集位点(P1:3.02±0.032 和 15.8±1.63;P2:5.9±0.413 和 8.59±0.31),且 H3K4me2修饰在PGCs上的富集水平显著高于ESCs(P<00.5),进一步研究发现LSD1和MLL2能够介导Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区发生差异性H3K4me2富集。以上结果在RNA水平和蛋白水平上验证了 H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导,为深入探究组蛋白如何介导信号通路参与PGCs的调控研究奠定基础。(2)H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28A/B促进PGCs形成通过生物信息学分析对Wnt信号下游TCF7L2转录因子的靶基因进行预测,并根据GO功能注释筛选其中参与生殖细胞发育及干细胞分化的高度保守的靶基因Lin28A和Lin28B;体内外实验证实Wnt5A/β-Catenin信号和组蛋白H3K4me2能够正向促进Lin28A和Lin28B的转录。成功构建了重组表达载体pEGFP-Lin28A/B,以此确定长片段具有启动活性;同时成功构建缺失载体PGL3-Lin28A/B,并确定Lin28A启动子核心调控区域为-584~+100bp和Lin28B启动子核心区域为-1431bp~-1034bp;进一步分析发现,Lin28A/B核心启动子核心区存在TCF7L2结合位点,将结合位点突变发现Lin28A/B启动子核心区域的活性几乎完全丧失。接下来,通过双荧光素报告基因检测系统证实Lin28A和Lin28B核心启动子区能够响应Wnt信号;通过ChIP-qPCR在PGCs中验证了 β-Catenin在Lin28A启动子区存在2个富集位点(P1:26.52±2.14;P2:8.32土 1.20),在 Lin28B 启动子区存在 3 个富集位点(P1:9.33土0.88；P2:4.90±0.53;P3:1.20土0.23),且β-Catenin水平变化能够差异性富集Lin28A/B启动子区,以上实验确定Lin28A/B是Wnt信号的直接靶基因。成功构建Lin28A/B过表达载体和干扰载体,并通过体内外实验探究Lin28A/B对PGCs形成的影响,结果发现:在过表达组诱导第4d出现类胚体,第6d类胚体数量变多,并且同时过表达Lin28A和Lin28B诱导第2天便开始出现较大的EB,第4d类胚体数量变大变多,第6d类胚体出现大量的细胞分裂,与 0d(1±0)相比,第 6d PGCs 标记基因 Cvh、C-kit 和 Blimp1 显著上升至 1.61±0.07、2.21±0.07和3.08±0.09(P<0.05),干扰组在同样的条件下则不能。体内对经Lin28A/B不同处理孵化至4.5d的鸡胚生殖嵴进行qRT-PCR检测发现相同的结果。流式细胞分析发现相较BMP4和BMP4+NC(3.31%±0.37和4.21%±0.21)组,体外同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH阳性率(5.86%±0.35),而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率(1.91%±0.02)极显著下调(P<0.01);体内流式细胞分析结果出现类似表达趋势:与Blank和NC(54.7%±3.12和52.6%±2.18)组相比,同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH 阳性率(66.7%±4.31),而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率(37.1%±1.97)极显著下调(P<0.01)。以上结果表明Lin28是受H3K4me2和Wnt信号调控的直接靶基因,且Lin28能正向调控PGCs的形成。(3)β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录通过ChIP-qPCR验证H3K4me2在Lin28A核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点(P1:14.96±1.41;P2:11.74±1.41),在Lin28B核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点(P1:3.08±0.041;P2:6.39±0.522),且 MLL2 和 LSD1 能够介导 Lin28A/B 启动子区 H3K4me2的差异富集;双荧光素报告基因检测发现H3K4me2甲基化能增强Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应,而H3K4me2去甲基化则降低Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应。成功构建LSD1-flag融合表达载体,并将LSD 1分别与TCF7L2和β-Catenin进行共转染DF1细胞,COIP验证发现LSD1能够与TCF7L2蛋白结合而不是β-Catenin蛋白,进一步将LSD1、TCF7L2和β-Catenin以不同组合形式转染DF1细胞,COIP检测发现β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2。以上实验结果表明β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录,解除LSD1对靶基因Lin28启动子区的H3K4me2去甲基化作用,激活Lin28表达。(4)Lin28A/B通过抑制gga-let7a-3p促进PGCs形成标记基因Blimp1的转录在线软件预测筛选了 micRNA-let7 家族 17 个鸡的 micRNA-let7s 成熟体(gga-let7s),在 ESCs、PGCs和DF1三种细胞中进行同时干扰或过表达Lin28A/B处理,通过qRT-PCR筛选处关键候选的micRNA,即gga-let-7a-2-3p。进一步预测发现gga-let7a-3p共有558个靶基因,根据Target Score由高到低对靶基因进行筛选,发现调控PGCs形成的关键标记基因Blimp1。对Blimpl 3’UTR区域的gga-let7a-3p三个结合位点进行全部缺失,成功构建了 Blimp1 3’UTR野生型和突变型载体,即Blimp1-3’UTR-WT和Blimp1-3’UTR-Mut;通过双荧光素酶报告基因检测验证gga-let-7a能够结合到Blimp1的3’UTR区域抑制其表达。以上结果表明Lin28A/B可能通过抑制gga-let7a-3p促进Blimp1的转录进而调控PGCs形成。