第一部分雷公藤甲素缓解白细胞介素10基因敲除小鼠术后吻合口炎症及纤维化目的:通过建立IL-10基因敲除（IL-10 Knock out,IL-10KO）小鼠回盲部切除,回结肠吻合（Ileocecal resection and anastomosis,ICA）模型,模拟人类克罗恩病（Crohn’s disease,CD）患者术后状态,并研究不同处理后IL-10KO小鼠术后肠道吻合口的变化情况及雷公藤甲素（Triptolide,TPL）对吻合口的影响。方法:采用IL-10KO小鼠作为CD模型,以回盲部切除、回结肠吻合方式模拟人类手术过程。选取8周龄野生型（Wild type,WT）小鼠12只,随机平均分为未手术组（WT）和手术组（WT-ICA）,同龄C3H/HeJBir IL-10KO小鼠18只,随机平均分为未手术组（IL-10KO）、手术组（IL-10KO-ICA）及TPL处理组（TT-IL-10KO-ICA）。根据相关文献描述对小鼠行疾病活动度评分（Disease activity index,DAI）,明确小鼠病情变化;收集小鼠肠道组织行HE染色,明确术后小鼠肠道炎症程度;免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测CD4表达,明确CD₄⁺细胞浸润情况;Masson染色明确小鼠肠道纤维化程度;Western blot检测小鼠肠道组织1、3型胶原（Collagen-1,3,Col-1,3）的变化情况;酶联免疫吸附实验（Elisa）检测小鼠肠道组织转移生长因子β（Transforming growth factor-β,TGF-β）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）、IL-6、IL-17、干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ）。结果:（1）术后8周处死小鼠,IL-10KO-ICA组小鼠回结肠吻合口可见明显肿胀,肠壁增厚,肠腔狭窄;肠道大体评分提示IL-10KO-ICA组较其他组明显升高（p<0.05）;但经TPL处理后,TT-IL-10KO-ICA组小鼠肠道大体评分虽仍高于WT、WT-ICA及IL-10KO组,但较IL-10KO-ICA组显著降低（p<0.05）;（2）IL-10KO小鼠可自发形成小肠结肠炎,因此IL-10KO小鼠相对特异性的克罗恩病疾病活动度评分（CDAI）和普通炎症性肠病疾病活动度评分（DAI）均提示,IL-10KO组小鼠评分较WT及WT-ICA组均明显升高（p<0.05）,IL-10KO-ICA组较其他组均明显升高（p<0.05）,而TPL可显著降低术后小鼠疾病活动度评分;（3）HE染色提示IL-10KO-ICA组小鼠肠道组织较其他组增厚明显,且可见大量炎症细胞浸润,炎症评分显著高于其他组,TPL处理后小鼠肠道炎症情况可得到显著改善;（4）IHC提示IL-10KO-ICA组小鼠吻合口周围肠道组织有大量CD₄⁺细胞浸润,而注射TPL后CD₄⁺细胞浸润面积显著降低;IL-10KO组小鼠肠道组织也可见一定程度的CD₄⁺细胞浸润;（5）Masson染色提示WT组小鼠肠壁未见明显胶原沉积,而WT-ICA组吻合口肠壁可见一定程度的胶原沉积,IL-10KO-ICA组小鼠吻合口肠壁全层均可见大量胶原组织沉积,以粘膜下层最为明显,注射TPL后,IL-10KO-ICA小鼠吻合口胶原沉积情况明显改善;（6）纤维化评分提示WT-ICA组较WT组明显升高（p<0.05）,而IL-10KO-ICA组较WT-ICA及IL-10KO组均明显升高（p<0.05）,TPL处理后,TT-IL-10KO-ICA组小鼠纤维化评分显著降低（p<0.05）;（7）Western blot提示,WT-ICA组小鼠Col-1、3合成较WT组明显升高（p<0.05）,IL-10KO-ICA组小鼠肠道组织Col-1、3合成较WT-ICA组及IL-10KO组明显增强（p<0.05）,TPL处理后,TT-IL-10KO-ICA组小鼠胶原合成明显减少（p<0.05）;（8）Elisa提示IL-10KO-ICA组小鼠吻合口IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α、TGF-β及IFN-γ等细胞因子表达较WT组及WT-ICA组均明显升高（p<0.05）,而TPL处理后TT-IL-10KO-ICA组所有细胞因子水平均有所下降,尤其是IL-6、TNF-α、TGF-β及IFN-γ。结论:IL-10KO小鼠可自发形成小肠结肠炎,对IL-10KO小鼠行回盲部切除及回结肠吻合可有效模拟人类CD患者术后吻合口炎症及纤维化等症状,TPL可显著缓解IL-10KO小鼠术后吻合口炎症及纤维化,并可抑制多种与炎症及纤维化密切相关的细胞因子的表达。第二部分TPL通过mi R-16-1/HSP70通路抑制IL-10KO小鼠吻合口成纤维细胞功能目的:通过细胞实验明确TPL对IL-10KO小鼠吻合口成纤维细胞mi R-16-1/HSP70通路的影响,以及mi R-16-1/HSP70通路与成纤维细胞性状之间的关系。方法:从小鼠肠道吻合口部位提取成纤维细胞（mouse intestinal fibroblast,MIF）,免疫荧光检测vimentin进行细胞鉴定,RT-q PCR检测成纤维细胞mi R-16-1表达,antagomir-16-1抑制mi R-16-1的表达,另外,利用agomir-16-1过表达TPL处理过的成纤维细胞的mi R-16-1,观察成纤维细胞性状变化情况。MTT实验检测细胞增殖性,划痕实验检测细胞迁移性,Western blot检测HSP70及Col-1、3表达情况。结果:（1）从IL-10KO-ICA组小鼠吻合口部位提取成纤维细胞,免疫荧光证实成纤维细胞特异性标记vimentin阳性;（2）TPL处理成纤维细胞后,mi R-16-1水平较处理前显著降低（p<0.05）;（3）荧光素酶报告实验证实,HSP70为mi R-16-1的直接作用靶点;（4）TPL处理成纤维细胞后,HSP70水平显著升高;（5）MTT实验提示,TPL处理成纤维细胞或抑制成纤维细胞mi R-16-1表达后,细胞增殖性较未处理时均显著降低（p<0.05）,而以TPL处理成纤维细胞后再以agomir-16-1过表达mi R-16-1,成纤维细胞增殖性较单独以TPL处理时显著增强（p<0.05）;（6）划痕实验及细胞迁移率提示,以TPL处理成纤维细胞或单独抑制成纤维细胞mi R-16-1表达后,细胞迁移性较未处理时均显著降低（p<0.05）,而以TPL处理成纤维细胞后再以agomir-16-1过表达mi R-16-1,细胞迁移率较单独用TPL处理时显著加快（p<0.05）;（7）Western blot结果提示,以TPL处理成纤维细胞或单独抑制成纤维细胞mi R-16-1表达后,细胞Col-1、3表达较未处理时均明显降低（p<0.05）而以TPL处理成纤维细胞后再以agomir-16-1过表达mi R-16-1表达,细胞Col-1、3合成较单独用TPL处理时显著增加（p<0.05）。结论:mi R-16-1/HSP70通路可受TPL调节;mi R-16-1/HSP70通路与成纤维细胞增殖性、迁移性及胶原合成能力密切相关。第三部分TPL通过mi R-16-1/HSP70通路影响IL-10KO小鼠术后吻合口纤维化目的:通过动物实验明确mi R-16-1/HSP70通路是否可影响IL-10KO小鼠术后吻合口纤维化,以及该通路在TPL缓解IL-10KO小鼠吻合口纤维化过程中的作用。方法:通过腹腔注射antagomir-16-1及agomir-16-1分别下调及上调IL-10KO小鼠腹腔mi R-16-1表达,观察小鼠一般情况及肠道吻合口纤维化情况,记录并比较各组小鼠疾病活动度评分,比较不同组小鼠纤维化评分,RT-q PCR检测小鼠肠道组织mi R-16-1水平,western blot及RT-q PCR检测小鼠肠道吻合口HSP70表达情况,western blot检测小鼠肠道组织Col-1及Col-3表达情况。结果:（1）腹腔注射antagomir-16-1可显著下调小鼠肠道mi R-16-1表达（p<0.05）;（2）单纯下调IL-10KO-ICA小鼠肠道mi R-16-1,小鼠疾病活动度评分包括DAI及CDAI较处理前均未有明显改变（p>0.05）;（3）单纯下调IL-10KO-ICA小鼠肠道mi R-16-1,肠道吻合口纤维化情况并未得到显著缓解,纤维化评分较未处理时并未出现显著差别（p>0.05）,且胶原蛋白合成较未处理时无明显差别（p>0.05）;（4）腹腔注射TPL可抑制IL-10KO-ICA吻合口mi R-16-1表达（p<0.05）;（5）腹腔注射agomir-16-1可上调肠道组织mi R-16-1表达,逆转TPL对mi R-16-1的抑制作用（p<0.05）;（6）通过agomir-16-1上调TPL处理的IL-10KO-ICA小鼠肠道mi R-16-1后,小鼠疾病活动度评分包括DAI和CDAI均单独TPL处理时明显升高（p<0.05）;（7）上调mi R-16-1表达可显著逆转TPL对IL-10KO-ICA小鼠吻合口纤维化的缓解作用,通过agomir-16-1上调TPL处理的IL-10KO-ICA小鼠mi R-16-1水平后,小鼠纤维化评分较单纯予TPL时显著升高（p<0.05）,且胶原蛋白合成量较单纯予TPL时显著增加（p<0.05）。结论:mi R-16-1/HSP70通路参与了TPL缓解IL-10KO-ICA小鼠肠道吻合口纤维化的过程。