【摘 要】
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目的:探讨胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)激活NOD2信号通路对负载白血病抗原的致敏树突状细胞(dendritic cell,DCs)的免疫调控作用。
方法:(1)梯度离心法获取健康
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目的:探讨胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)激活NOD2信号通路对负载白血病抗原的致敏树突状细胞(dendritic cell,DCs)的免疫调控作用。
方法:(1)梯度离心法获取健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),体外给予重组人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor , rhGM-CSF )、重组人白介素-4 ( recombinant human interleukin-4,rhIL-4)、重组人肿瘤坏死因子α(recombinant human tumor necrosis factorα,rhTNF-α)诱导培养7天,诱导第5天给予白血病细胞株HL-60冻融抗原致敏DCs,得到致敏DCs。(2)给予不同浓度MDP(1000ng/ml, 2000ng/ml,3000ng/ml)刺激致敏DCs,作用24小时,半定量RT-PCR检测NOD2 mRNA的表达,观察不同浓度MDP对致敏DCs内NOD2的表达影响。(3)实验分组:实验共分为四组,即不给于任何刺激的成熟DCs组、成熟DCs+MDP组(MDP2000ng/ml,24h),负载白血病细胞HL-60冻融抗原致敏DCs组(简称致敏DCs组)、致敏DCs+MDP组(MDP2000ng/ml,24h)。(4) RT-PCR和western-blot分别检测NOD2 mRNA和蛋白表达。(5)流式细胞仪分析各组DCs表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD40的表达。(6)ELISA法检测各组DCs培养上清中IL-12p40表达。
结果:(1)用贴壁法得到的PBMC,经过细胞因子诱导后,其形态以及流式表型符合DCs细胞特点。(2)用不同浓度MDP刺激致敏DCs后,RT-PCR结果显示,随着MDP浓度增加,NOD2 mRNA的表达显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3) MDP作用于经不同方式处理的DCs后,各组DCs内NOD2 mRNA和蛋白表达均上调,并以致敏DCs+MDP组最高,其作用显著高于仅给予MDP刺激的DCs+MDP组和无MDP刺激的致敏DCs组,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)流式细胞术显示各组DCs表面分子(HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD40)表达变化规律基本一致,以致敏DCs+MDP组表达最高依次为(96.23±3.67)%,(76.83. ±5.83)%,(45.23±4.92)%, (72.33±7.00)%,(45.53±1.53)%,其明显高于DCs+MDP组和致敏DCs组,未处理DCs表达最低,即(80.27±5.36)%,(49.27±2.24)%,(25.50±4.60)%,(45.23±4.92)%, (23.80±1.15)%,差异有统计学意义(p<0.05)。(5)与无任何处理的DCs组比较,给予MDP刺激或冻融抗原致敏后,IL-12p40分泌增加,且DCs+MDP组(573.86± 32.09pg/ml)高于致敏DCs组(365.03±28.86 pg/ml),差异有统计学意义(p<0.05),以致敏DCs+MDP分泌细胞因子IL-12p40最高为(898.30±61.08)pg/ml。
结论:(1)MDP可以上调致敏DCs内NOD2的表达,其上调水平与MDP的浓度成正相关。(2)MDP上调致敏DCs内NOD2 mRNA和蛋白表达的同时,可以促进致敏DCs 表面HLA-DR、协同共刺激分子、粘附分子表达及炎性因子IL-12p40分泌,有望为DCs在白血病免疫治疗中的应用提供新思路。
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