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背景：流行病学调查表明,病态窦房结综合征(sick sinus syndrome,SSS,简称病窦),是临床难治性的重大疑难心血管疾病,属慢性渐进性疾病,高发病率、高危险性已经引起人们的普遍关注。因此,病窦的治疗及研究成为亟待解决的医学疑难问题。SSS目前尚无根治措施,西医治疗以阿托品、肾上腺素、氨茶碱等药物提高心率为主,副作用大；安装及更换单腔起搏器大约为2.89万费用较贵,且存在严重的禁忌症和并发症。因此,寻求安全、有效、廉价的治疗方法成为一种迫切需要。窦房结是心脏自律性的发源地,其起搏功能的正常对维持心脏正常的泵血功能尤为重要。早在上个世纪50年代,细胞膜兴奋理论认为,细胞膜离子通道的综合作用是心脏起搏的主要机制(membrane clock,膜钟),其中包括超极化激活的起搏电流(If)、内向整流钾电流(IK1)、SCN5A编码的钠电流(INa)、钙电流(ICa)等。窦房结细胞(SNC)超极化激活环核苷酸门控(HCN)通道(hyperpolarization-activated current,简称If通道)在维持SNC自律性方面具有举足轻重的作用,SSS的产生与SNC结构的破坏、活性和自律性的降低直接相关近年研究表明,大多数学者认为SSS临床表现以本虚标实为主,本虚以气虚、阳虚多见,提出从整体入手,通过多环节、多靶点缓解病情,提高患者生存率、改善生存质量。中国中医科学院广安门医院刘志明老中医临证70余年经验认为SSS的临证以阳虚血瘀为主,故提炼治疗SSS有效方剂—通阳活血方(THR),为原创经验方。前期对该方进行了多中心临床研究表明该方治疗病窦疗效确切、安全性好；基础实验研究表明该方通过多靶点、多途径起作用。因此,深入挖掘名老中医治疗病窦的宝贵经验,探讨修复受损窦房结结构和功能的电生理机制,具有重要的临床意义和应用价值。目的：在以往用于细胞研究的乳兔窦房结细胞(SNC)分离方法基础上进行改良,成功分离、培养出适用于全细胞膜片钳技术的乳兔SNC,进一步探讨THR含药血清、中药原液以及主要有效成分对乳兔缺血再灌SNC动作电位(AP)相关参数、起搏电流的影响和信号转导机制,以揭示THR治疗SSS的细胞电生理机制,为名老中医经验方治疗病窦提供科学依据,为传承名老中医经验提供借鉴。方法：1.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、100、200、300μl通阳活血含药血清组及100μl空白血清组,除正常组,其余各组细胞均模拟缺血-再灌注(I-R)法制备乳兔SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察空白血清及通阳活血方含药血清对各组SNC自发性搏动频率、作电位时程APD20、APD50、APD90、最大舒张电位(MDP)、动作电位幅值(APA)的影响。2.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、100、200、300μl含药血清组及通阳活血中药原液组,除正常组,其余各组细胞模拟I-R法制备SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察THR中药原液及含药血清对各组SNC超极化环核苷酸门控阳离子通道电流起搏电流(If)电流-电压曲线及相关门控机制的影响。3.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L人参Rb1、黄芪甲苷,除正常组,其余各组细胞模拟I-R法制备SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察人参Rb1、黄芪甲苷对各组SNC超极化环核苷酸门控阳离子通道电流起搏电流(If)电流-电压曲线及相关门控机制的影响。4.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、1μmol/L激动剂Forskolin和100μmol/L选择性抑制剂H89,除正常组,其余各组细胞模拟I-R法制备SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察Forskolin、H89高中低剂量对各组SNC超极化环核苷酸门控阳离子通道电流起搏电流(If)电流-电压曲线及相关门控机制的影响。结果：1.“双酶解+差速贴壁”差速贴壁5d后细胞主要呈3种形态：梭形、蜘蛛形与多边形,梭形细胞数目最多(61.5±6.8),搏动频率快,(136±12)次/min；蜘蛛形细胞胞体较大,多伸有伪足,搏动频率较梭形细胞慢(106±9)次/min；少量多边形细胞体积较大、少伪足且无搏动,细胞平坦、胞浆清亮。2.与正常组比较,模拟I-R造模后SNC的APD20由正常(25.7±4.8)ms延长至(82.6±5.3)ms,具有显著统计学差异(P<0.05),于造模后细胞外液分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后,APD20分别缩短至(42.7±6.7)ms.(53.3±6.5)ms.(41.5±6.4)ms,差别均具有统计学意义(P<0.05),三个含药血清组之间比较则无统计学差异。与正常组比较,模拟I-R造模后SNC的APD5o由正常(78.79±5.3)ms延长至(152.5±5.6)ms,具有极显著统计学差异(P<0.01),于造模后细胞外液分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后,APD5o分别缩短至(98.2±6.4)ms.(123.9±4.9)ms.(114.2±4.9)ms,差别均具有统计学意义(P<0.01),其中100μl含药血清组缩短比200、300μl含药血清组更明显(P<0.05),但200lμl和300μl含药血清组比较无统计学意义。与正常组比较,模拟I-R造模后SNC的APD90虽有延长,但无统计学意义(P>0.05)。于造模后细胞外液分别加入100、200、300μ1通阳活血方含药血清后,APD90的改变无统计学意义(P>0.05)。3.与正常组比较,模拟I/R造模后SNC的MDP由正常的(-65.6±4.8)mV变为(-53.9±5.8)mV,APA则由正常的(85.2+3.8)mV降低至(73.7±4.9)mV,均具有显著性统计学差异(P<0.01)。分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后,各组MDP值无明显改变(P>0.05),100μl和300μl含药血清分别使APA升高至(84.3+4.8)mV和(83.4±6.3)mV,具有显著性统计学差异(P<0.01),但两组间比较无统计学意义：与模型组比较,200μl含药血清对APA虽有升高,但无统计学差异。与模型组比较,100μl空白血清组MDP及APA均无明显改变(P>0.05)4.正常组窦房结细胞If峰值电流密度为(-43.48±1.08)pA/pF,模拟I/R后SNCIf峰值电流密度降至(-19.64±2.14)pA/pF,具有极显著性差异(P<0.01)分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后If峰值电流密度有不同程度的增大,分别升高至(-94.90±0.66)pA/pF、(-115.37±1.62)pA/pF、(-122.54±1.11)pA/pF(P<0.01).空白血清组与模型组比较,If峰值电流密度无明显变化。分别于正常细胞外液加入100μl通阳活血方含药血清及空白血清后,含药血清组If峰值电流密度较正常组有所升高(P<0.05),空白血清组则无明显变化。模拟I/R后SNC在分别加入100、200、300μl通阳活血方原液后,If峰值电流密度亦有不同程度的增大,分别升高至(-60.27±1.47) pA/pF、(-69.70±1.67) pA/pF、(-76.03±1.59) pA/pF (P<0.01)。分别于正常细胞外液加入100μl通阳活血方中药原液后,If峰值电流密度有所升高(P<0.01)。5.正常组窦房结细胞If峰值电流密度为(-43.48±1.08) pA/pF,模拟I/R后SNC If峰值电流密度降至(-19.64±2.14)pA/pF,具有极显著性差异(P<0.01)。加入100、200、400μmol/L人参Rb1后,If峰值电流密度有不同程度的增大,分别升高至(-22.99±1.75)pA/pF(P<0.05)、(-24.39±2.38) pA/pF、(-40.55±1.33)pA/pF(P<0.01)。分别于正常细胞外液加入100μmol/L人参Rb1, If峰值电流密度较正常组有所升高,但无统计学意义(P>0.05)。模拟I/R后SNC在分别加入100、200、400μmol/L黄芪甲苷后,If峰值电流密度亦有不同程度的增大,分别升高至(-30.43±1.98) pA/pF、(-34.83±1.6) pA/pF、(-52.72±1.7) pA/pF (P<0.01)。分别于正常细胞外液加入100μmol/L黄芪甲苷后,If峰值电流密度有所升高(P<0.05)6.正常组窦房结细胞If峰值电流密度为(-43.48±1.08) pA/pF,模拟I/R后SNC If峰值电流密度降至(-19.64±2.14) pA/pF,具有极显著性差异(P<0.01)。参照文献,在浴液中加入10μmol/LH89后,If峰值电流密度有不同程度的减小,下降至(-11.56±2.34) pA/pF (P<0.01)。后于浴液中分别加入100μl的含药血清和中药原液,If峰值电流密度有不同程度的升高,分别升高至(-12.45±2.16) pA/pF (P>0.05)、(-11.84±1.75) pA/pF (P>0.05)。在浴液中加入1μmol/L Forskolin后,If峰值电流密度有不同程度的上升至(-25.82±1.53)pA/pF (P<0.05)。后于浴液中分别加入100μl的含药血清和中药原液,If峰值电流密度有不同程度的升高,分别升高至(-61.03±2.48) pA/pF (P<0.01)(-51.60±2.47) pA/pF (P<0.01)结论：1.通阳活血方含药血清可加快乳兔受损SNC自发性搏动频率,缩短作电位时程APD20、APD50,增大乳兔受损SNC的APA,同时可保护乳兔受损SNC形态结构,从而提高心率,2.通阳活血方含药血清及中药原液能电压依赖性增大受损乳兔SNC的If电流密度,加快If通道稳态激活,恢复降低的If电流密度,以缩短SNC动作电位的舒张去极,从而提高其自律性。3.人参Rb1、黄芪甲苷可电压依赖性增大受损乳兔SNC的If电流密度,加快If通道稳态激活,恢复降低的If电流密度,以缩短SNC动作电位的舒张去极。4.通阳活血方含药血清及中药原液作用于If受PKA信号转导的影响。5.通阳活血方可能是通过上述机制增强SNC If以缩短动作电位时程,改善SNC起搏功能,从而加快心率。