核酸分子杂交作为分子生物学的基本技术已被广泛用于医学基础和临床研究。因其具有灵敏度高、特异性好和相对简易的优点，已被用于多种病原体的检测。 本研究采用醋酸泼尼松龙诱导建立卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia,PCP)大鼠模型，获得实验所需的基本材料。以随机引物法制备地高辛标记的非放射性探针，采用斑点杂交检测大鼠模型肺组织和患者临床标本中的卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii,Pc)DNA。 1．PCP大鼠模型的建立、Pc检测及实验标本的采集 采用SD大鼠，醋酸泼尼松龙腹股沟皮下注射2个月，诱导建立PCP动物模型。无菌操作取出死亡大鼠的肺组织，切面做印片，分别进行吉氏染色和快速银染，显微镜下查找Pc。从每只大鼠的肺组织中分离Pc包囊和滋养体，提取DNA用于PCR反应。琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察，见到约350bp大小的DNA条带为阳性。其余的肺组织保存于-20℃备用。 结果：病原学检查结果显示成功建立了PCP动物模型。检测结果显示，吉氏染色检出率为80％，快速银染检出率为50％，PCR检出率为95％，后者明显高于吉氏染色和快速银染法。PCP动物模型的诱导成功及肺组织的获得为后续的实验研究奠定了基础。 唐京医矜大学硕士学位技文2．PC特异性目白基因的获得及序列测定 以 Wakefield等设计的 MI 02－E和 PAZ 02－H为引物，采用常规 PCR扩增计的线粒体核糖体 RNA大亚基（LSU mt r伽A）基因。琼脂糖凝胶电泳后将含有约350hp大小DNA条带的凝胶切割，回收其中DNA片段。将所得基因片段测序，采用Blast软件将该段基因序列与GeneBank中已公布序列比对确认所得基因的来源。结果：测序结果显示所得基因片段长为357hP，与GeneBank中的D有序列比对；结果显示所得基因与 Sinclair等公布的 Pc LSU mt rRNA基因的同源性为 99儿 故确认是 PC特异的基因。该基因的获得及鉴定为探针的制备及检测提供了必需的材料，并保证了探针的特异性。3．PC特异性DNA探针的制备及其实验应用 以获得的PC特异性DNA为模板，采用随机引物法制备地高辛标记的非放射性探针。以已知浓度的地高辛标记的DNA为参照确定探针的浓度，随后检测该探针的特异性和敏感性。将该探针用于斑点杂交检测大鼠肺组织和肾移植并发PCP 患者支气管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage，BAL）标本中的 Pc DNA。结果：实验中所得探针浓度为30ng／ul，显色敏感性为…，杂交敏感性为沙，特异性检测显示该探针不与小鼠伯氏疟原虫、人恶性疟原虫、弓形虫、正常人白细胞和正常宿主（大鼠）肺组织DNA反应，仅与 PC DNA反应，杂交后显色出现紫红色斑点。将该探针用于斑点杂交检测大鼠模型肺组织中的几，检出率为 73．7％，肾移植并发PCP患者的 B队标本中未检测到八 DNA。将这些标本采用 PCR扩增后结合杂交重新检测，检出率为 94．7y，在肾移植并发 PCP患者的 BAL中检出 PC DNA。