容积调节性氯通道(volume-regulated chloride channel,VRCC)广泛分布于多种组织和细胞,在调节细胞容积、稳定细胞膜电位、维持细胞兴奋性及胞内酸碱平衡等方面起重要作用。关于VRCC的分子基础一直都存在争论,但至少在血管平滑肌上我们实验室在A10细胞证实了C1C-3编码了VRCC。近年来的研究表明容积调节性氯通道参与调节了细胞增殖及凋亡。我们先前在血管平滑肌细胞上研究发现VRCC的阻断剂DIDS可以浓度依赖性抑制内皮素-1(endothelin-1,ET-1)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖。随后在人宫颈癌细胞,肝细胞,T淋巴细胞,成纤维细等细胞系上证实抑制VRCC的同时可以抑制细胞增殖。过表达C1C-3可以促进ET-1诱导的细胞增殖及抑制细胞凋亡,沉默C1C-3可以抑制细胞的增殖及促进细胞凋亡。这些结果表明VRCC参与调节了高血压、动脉硬化等脑血管病变的血管重构(vascularremodeling)。　　 血管平滑肌细胞胞浆Ca2+浓度升高是引起血管收缩和重构的重要因素。胞浆Ca2+浓度升高主要是由胞外Ca2+内流和胞内Ca2+池的Ca2+释放引起。其中胞外Ca2+内流是引起胞浆Ca2+水平持续性升高的关键环节。目前已知,在血管平滑肌介导胞外Ca2+内流的主要有电压依赖性Ca2+通道(voltage-dependent calciumchannel,VDCC)、受体操纵性Ca2+通道(receptor-operated calcium channel,ROCC)和Ca2+池操纵性Ca2+通道(store-operated Ca2+channel,SOCC)。VDCC是指随膜电位变化而开闭的一类Ca2+通道。ROCC的开放仅与膜受体被激活相关,而与膜去极化无关。SOCC主要是由胞内Ca2+池耗竭所激活,无需受体激活和第二信使的产生,一些胞内Ca2+池Ca2+泵的抑制剂可通过直接作用于胞内Ca2+池的Ca2+-ATP酶而抑制自Ca2+池漏入胞浆钙的回摄,最终导致Ca2+池耗竭,进而激活SOCC。尽管对VDCC、ROCC、SOCC的激活机制进行了大量的研究,但仍未能阐明其确切的调节机制,在不同的细胞可能存在不同的信号通路加以调节。　　 容积调节性氯通道可被细胞肿胀、降低细胞外渗透压所激活,但细胞肿胀激活VRCC具体的信号调节机制尚不清楚。最近的研究表明,很多因素都能调节VRCC,蛋白激酶A、蛋白激酶C、G-蛋白、钙/钙调蛋白激酶、蛋白酪氨酸激酶以及细胞骨架等一些细胞内调节因子均参与调控VRCC的开放。VRCC的分子基础C1C-3在血管平滑肌细胞主要表达在细胞膜和细胞浆,C1C-3可以通过clathrin介导的等运输途径在胞膜和胞浆穿梭,来维持其在细胞内特殊的亚定位,进而发挥一系列的特有功能。EndophilinⅡ属于Endophilin家族的EndophilinA亚族。EndophilinⅡ蛋白广泛分布于各种组织和细胞,主要参与网格蛋白介导的囊泡内吞。EndophilinⅡ作为clathrin介导的运输途径的重要组成部分,是否会参与VRCC的转运及影响其功能,起外EndophilinⅡ与一些调节VRCC的激酶及细胞骨架都有相互作用,那么EndophilinⅡ是否会参与调控VRCC的开放,机制如何?　　 在平滑肌细胞,因为Cl-的平衡电位高于细胞的静息膜电位,所以细胞膜上Cl-通道开放引起Cl-外流,细胞去极化,进而引起L-型VDCC开放。我们最近的研究表明,Cl-通道不仅参与调节VDCC的开放,亦参与调节经ROCC和SOCC的Ca2+内流。过表达C1C-3可以增加OAG,Phe,TG诱导的Ca2+内流,沉默C1C-3可以抑制OAG,Phe,TG诱导的Ca2+内流。一些Cr通道阻断剂如IAA-94和DIDS等可引起脑血管平滑肌细胞超极化并舒张血管。这些结果提示容积调节性C1C-3通道与Ca2+通道之间关系密切,两者之间可能存在某种内在的联系,但具体的作用方式及调节机制不是很清楚。最近的研究发现,在神经末梢,EndophilinⅡ可以和电压依赖性钙通道相结合,且这种结合是钙浓度依赖性的,低浓度结合,高浓度解聚。那么在血管平滑肌细胞EndophilinⅡ和钙通道有无联系,对钙运动的调节机制是否有影响,会不会是容积调节性C1C-3通道与Ca2+通道相互作用的媒介,目前还没有相关的报道。　　 综上所述,容积调节性C1C-3通道与Ca2+通道可能因为某种联系而相互影响,EndophilinⅡ可能参与了C1C-3蛋白的运输与调节,又可以结合VDCC,因此本课题拟在探讨EndophilinⅡ对容积调节性C1C-3通道与Ca2+通道相互作用的研究,拟回答以下几个问题:1)脑基底动脉平滑肌细胞上是否有内源性EndophilinⅡ的表达.2)EndophilinⅡ是否对容积调节性C1C-3氯通道及细胞增殖有影响?3)EndophilinⅡ对脑基底动脉平滑肌细胞钙运动有无影响。　　 试验第一部分我们通过过表达和沉默EndophilinⅡ蛋白,采用单细胞荧光影像分析系统和膜片钳技术分析EndophilinⅡ对容积调节性C1C-3氯通道的影响及其在细胞增殖中的作用。第二部分采用猛淬灭,单细胞测钙,膜片钳等技术分析EndophilinⅡ对脑基底动脉平滑肌细胞钙运动的影响.　　 第一部分EndophilinⅡ对容积调节性C1C-3氯通道的影响及其在细胞增殖中的作用1.基底动脉血管平滑肌细胞内源性EndophilinⅡ蛋白的表达Western blot分析表明大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞上有内源性EndophilinⅡ蛋白表达,分子量为45kDa。　　 2.EndophilinⅡ对容积调节性C1C-3氯通道的影响2.1过表达EndophilinⅡ后,BASMCs由等渗换成低渗溶液灌流,细胞内氯离子浓度由32.2±3.1mM降低到15.2±2.1mM,胞内氯离子降低率为52.8±5.9％,与对照组氯离子浓度由32.7±2.8mM降低到22.7±2.5mM,胞内氯离子降低率为30.6±4.2％相比有统计学意义。脂质体组和载体组与对照组无明显差异。　　 2.2沉默Endophilin±后,BASMCs由等渗换成低渗溶液灌流,细胞内氯离子浓度由33.7±2.2mM降低到27.6±1.6mM,胞内氯离子降低率为18.1±4.2％,与对照组氯离子浓度由33.8±1.8mM降低到22.1±2.0mM,胞内氯离子降低率为34.6±4.0％相比有统计学意义。脂质体组和阴性对照组与对照组无明显差异。　　 2.3胞内透析抗EndophilinⅡ抗体可以浓度依赖地抑制VRCC,0.5,5,50,500,5000 ng/ml的抑制率分别是10.0±1.9％、36.2±2.7％、44.7±1.2％、51.5±1.1％、51.3±1.4％,但透析抗原预吸附抗EndophilinⅡ抗体对VRCC无作用。　　 2.4过表达EndophilinⅡ后,可以增强VRCC,在-100mV和+100mV的电流密度为-28.4±4.9和72.6±5.0 pA·pF-1,与对照组细胞在-100mV和+100mV的电流密度-15.0±5.1和44.5±6.8 pA·pF-1相比,有显著性差异。脂质体组和载体组与对照组无明显差异。　　 2.5沉默EndophilinⅡ后,可以抑制VRCC,在-100mV和+100mV的电流密度为-14.5±2.5和41.4±5.6 pA·pF-1,与对照组细胞在-100mV和+100mV的电流密度-45.9±2.1和118.4±7.7 pA·pF-1相比,有显著性差异。脂质体组和阴性对照组与对照组无明显差异。　　 2.6免疫共沉淀表明EndophilinⅡ与C1C-3蛋白相互作用形成复合体2.7过表达和沉默EndophilinⅡ对总C1C-3蛋白表达与对照组相比无显著差异。　　 2.8沉默EndophilinⅡ后可以抑制C1C-3蛋白由胞浆向胞膜转运。同对照组比,胞浆C1C-3蛋白增加了2.2±0.4倍,胞膜C1C-3蛋白降低了0.45±0.2倍,有显著性差异；同时也减少了EndophilinⅡ与C1C-3蛋白相互作用。阴性对照组与对照组无明显差异。　　 2.9过表达EndophilinⅡ可以增加EndophilinⅡ与C1C-3蛋白的相互作用,促进C1C-3蛋白由胞浆向胞膜转运。胞膜C1C-3蛋白增加了1.96±0.36倍,胞浆C1C-3蛋白降低了0.53±0.19倍,同对照组相比均有显著性差异。　　 3.EndophilinⅡ在大鼠脑基底动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的作用3.1.siRNA对ET-1和低渗诱导的EndophilinⅡ蛋白的表达10nmol·L-1 ET-1处理BASMCs48小时后,EndophilinⅡ蛋白表达与对照组相比增加了1.9±0.25(P<0.05,vs control,n=6)倍,转染siRNA片段能使ET-1诱导的C1C-3蛋白表达增加抑制了82.3±9.2％(P<0.05,vs ET—1,n=6)。25％低渗培养基培养BASMCs24小时后,结果表明EndophilinⅡ蛋白表达与等渗对照组相比增加了2.2±0.30(P<0.05,vs iso,n=6)倍,转染siRNA片段能使低渗培养基诱导的EndophilinⅡ蛋白表达增加抑制了85.1±10.2％(P<0.05,vs hypo,n=6)3.2.沉默EndophilinⅡ蛋白对基底动脉血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响3.2.1沉默EndophilinⅡ蛋白对ET-1诱导的细胞增殖和细胞周期的影响用细胞计数和CCK-8(cell counting kit-8)试验分析细胞增殖。基底动脉平滑肌细胞数目在ET-1处理组(ET-1)、ET—1+hyperfect处理组、ET-1+negative siRNA处理组、ET-1+EndophilinⅡ siRNA处理组按相对于对照组的百分比表示分别为:134±6％,133±5％,136±7％(P<0.01,vs control,n=6)及108±4％(P<0.01,vs ET—1,n=6)。CCK-8法检测细胞活力在ET-1处理组(ET-1)、ET-1+hyperfect处理组、ET—1+negative siRNA处理组、ET-1+EndophilinⅡ siRNA处理组按相对于对照组的百分比表示分别为129±7％,128±5％,127±6％(P＜0.01,vs control,n=6)及109±5％(P<0.01,vs ET-1,n=6)。流式细胞仪分析细胞周期,结果显示:基底动脉平滑肌细胞G0/G1期的细胞数目比例在对照组、ET-1处理组、ET-1+hyperfect处理组、ET-1+negative siRNA处理组、ET-1+EndophilinⅡ siRNA处理组分别为89.0±2.9％,76.6±2.7％,76.1±3.1％,75.5±3.0％,86.1±3.3％。处于S期的细胞数目比例在对照组、ET-1处理组、ET-1+hyperfect处理组、ET-1+negative siRNA处理组、ET-1+EndophilinⅡ siRNA处理组分别7.5±2.5％,20.4±2.1％,19.9±3.0％,21.0±3.2％,9.4±3.5％。siRNA沉默EndophilinⅡ表达后G0/G1期的细胞数目比例从76.6±2.7％增加到86.1±3.3％(P<0.01,n=6),与之对应S期的细胞数目比例从20.4±2.1％下降到9.4±3.5％(P<0.01,n=5)。　　 3.2.2沉默EndophilinⅡ蛋白对低渗诱导的细胞增殖和细胞周期的影响用细胞计数和CCK-8(cell counting kit-8)试验分析细胞增殖。基底动脉平滑肌细胞数目在低渗(hypo)处理组、hypo+hyperfect处理组、hypo+negative siRNA处理组、hypo+EndophilinⅡ siRNA处理组按相对于等渗对照组(iso)的百分比表示分别为:130±4％,129±6％,132±6％(P<0.01,vs iso,n=6)及106±5％(P<0.01,vshypo,n=6)。CCK-8法检测细胞活力在hypo处理组、hypo+hyperfect处理组、hypo+negative siRNA处理组、hypo+EndophilinⅡ siRNA处理组按相对于等渗对照组(iso)的百分比表示分别为:131±6％,127±5％,130±6％(P<0.01,vs iso,n=6)及110±4％(P<0.01,vs hypo,n=6)。流式细胞仪分析细胞周期结果显示:基底动脉平滑肌细胞G0/G1期的细胞数目比例在等渗对照组(iso)、hypo处理组、hypo+hyperfect处理组、hypo+negative siRNA处理组、hypo+EndophilinⅡ siRNA处理组分别为87.1±2.4％,74.7±2.8％,76.1±2.6％,75.6±2.3％,84.7±3.0％。处于S期的细胞数目比例在等渗对照组(iso)、hypo处理组、hypo+hyperfect处理组、hypo+negative siRNA处理组、hypo+EndophilinⅡ siRNA处理组分别为8.8±2.1％,20.1±2.9％,18.9±2.3％,19.7±2.4％,10.0±2.3％。siRNA沉默EndophilinⅡ表达后G0/G1期的细胞数目比例由74.7±2.8％增加到84.7±3.0％(P<0.01,n=6),与之对应S期的细胞数目比例由20.1±2.9％下降到10.0±2.3％(P<0.01,n=6)。　　 3.3过表达EndophilinⅡ蛋白对ET-1诱导的细胞增殖和细胞周期的影响3.3.1过表达EndophilinⅡ蛋白对ET-1诱导的细胞增殖和细胞周期的影响将EndophilinⅡ cDNA全长质粒载体转入基底动脉平滑肌细胞可明显增加EndophilinⅡ蛋白表达。转染后细胞增殖实验(cck-8)表明:lipofectamine处理组、vector处理组、ET-1+vector处理组、ET-1+EndophilinⅡ cDNA处理组细胞活力按相对于对照组(control)的百分比表示分别为:96±5％,105±6％,128±6％(P<0.01,vs control,n=6)及146±7％(P<0.01,vs ET-1+vector,n=6)。流式细胞仪分析细胞周期结果显示:基底动脉平滑肌细胞G0/G1期的细胞数目比例在对照组、lipofectamine处理组、vector处理组、ET-1+vector处理组、ET-1+EndophilinⅡcDNA处理组分别为91.7±3.5％,90.5±3.0％,87.8±3.2％,75.9±3.6％,60.2±3.9％。处于S期的细胞数目比例在对照组、ET-1处理组、ET-1+lipofectamine处理组、ET-1+vector处理组、ET-1+EndophilinⅡcDNA处理组分别4.8±1.5％,5.7±1.6％,6.2±1.1％,20.5±3.2％,35.6±4.6％。过表达EndophilinⅡ后G0/G1期的细胞数目比例从75.9±3.6％下降到60.2±3.9％(P＜0.01,n=6),与之对应S期的细胞数目比例从20.5±3.2％增加到35.6±4.6％(P<0.01,n=6)。表明外源性转染全长EndophilinⅡcDNA使之过表达后可加快ET-1诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖的速度及促进细胞通过Gl/S checkpoint.。　　 3.3.2过表达EndophilinⅡ蛋白对低渗诱导的细胞增殖和细胞周期的影响将EndophilinⅡ全长质粒载体转入基底动脉平滑肌细胞后,细胞增殖实验(cck-8)表明:lipofectamine处理组、vector处理组、hypo+vector处理组、hypo+EndophilinⅡcDNA处理组细胞活力按相对于等渗对照组(iso)的百分比表示分别为:97±6％,103±7％,126±6％(P<0.01,vs iso,n=6)及149±7％(P<0.01,vshypo+vector,n=6)。流式细胞仪分析细胞周期结果显示:基底动脉平滑肌细胞G0/G1期的细胞数目比例在等渗对照组(iso)、hypo处理组、hypo+lipofectamine处理组、hypo+vector处理组、hypo+EndophilinⅡ cDNA处理组分别为90.3±4.1％,85.1±3.2％,89.3±3.7％,74.3±3.1％,62.2±3.4％。处于S期的细胞数目比例在等渗对照组(iso)、lipofectamine处理组、vector处理组、hypo+vector处理组、hypo+EndophilinⅡcDNA处理组分别为5.6±1.7％,7.3±1.3％,5.2±1.9％,21.9±3.0％,34.1±3.7％。过表达EndophilinⅡ后G0/G1期的细胞数目比例由74.3±3.1％下降到62.2±3.4％(P<0.01,n=6),与之对应S期的细胞数目比例由21.9±3.0％增加到34.1±3.7％(P<0.01,n=6)。表明外源性转染全长EndophilinⅡcDNA使之过表达后可加快低渗诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖的速度及促进细胞通过Gl/S checkpoint.。　　 3.4沉默EndophilinⅡ蛋白对ET-1诱导的容积调节性CIC-3氯通道的影响ET-1可以诱导VRCC活性增加。10nM ET-1预敷培养48h后,在-100mV和+100mV的电流密度为-26.7±3.6和75.7±5.5 pA·pF-1。与对照组细胞在-100mV和+100mV的电流密度-13.3±4.6和44.8±6.2 pA·pF-1相比,有显著性差异。沉默EndophilinⅡ蛋白后,在-100mV和+100mV的电流密度分别由-26.7±3.6和75.7±5.5 pA·pF-1下降到-17.8±3.7和51.2±3.6 pA·pF-1(n=6,p<0.01 versus ET-1)。　　 小结　　 1)大鼠脑基底动脉平滑肌细胞上有内源性EndophilinⅡ蛋白表达,分子量45KD2)过表达EndophilinⅡ可以增强容积调节性C1C-3氯通道活性3)沉默EndophilinⅡ可以抑制容积调节性C1C-3氯通道活性4)胞内透析抗EndophilinⅡ抗体可以浓度依赖地抑制VRCC5)沉默EndophilinⅡ减少EndophilinⅡ与C1C-3相互作用,抑制C1C-3由胞浆向胞膜转位,降低C1C-3在膜上的表达6)过表达EndophilinⅡ增加EndophilinⅡ与C1C-3的相互作用,促进C1C-3由胞浆向胞膜转位,增加C1C-3在膜上的表达。　　 7)ET-1和低渗培养基可诱导EndophilinⅡ蛋白表达增加。　　 8)沉默EndophilinⅡ抑制ET-1和低渗培养基诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖及阻止基底动脉平滑肌细胞周期从G0/G1期进入S期,阻止DNA的合成。　　 9)EndophilinⅡ过表达加快ET-1和低渗培养基诱导的基底动脉平滑肌细增殖及促进基底动脉平滑肌细胞周期从G0/G1期进入S期,促进DNA的合成。　　 10)沉默EndophilinⅡ蛋白可以抑制ET-1诱导的容积调节性C1C-3氯通道活性增加.　　 本部分实验采用Fura-2荧光探针测定单细胞胞浆Ca2+浓度技术,Fura-2荧光的Mn2+淬灭实验技术及采用膜片钳全细胞记录技术,观察沉默EndophilinⅡ后对脑基底动脉平滑肌细胞ROCC的激动剂OAG引起的Ca2+内流,Ca2+池Ca2+泵抑制剂TG引起的Ca2+释放和Ca2+内流以及VDCC激动剂BayK8644引起的Ca2+内流的影响。结果表明:　　 1.沉默EndophilinⅡ后,在1μmol.L-1 nifedipine存在的条件下,100umol.L-1 OAG引起的Ca2+内流量为5.5±1.8(ratio340/380％),低于对照组的Ca2+内流11.2±1.7(n=6,P<0.01),两者间有显著性差异。而转染negative和hyperfect组Ca2+内流分别为10.9±1.9和11.8±2.0(n=6),与对照组相比均无差异。　　 2.沉默EndophilinⅡ后,在1μmol.L-1 nifedipine存在的条件下,1μmol.L-1 TG引起的Ca2+释放和Ca2+内流分别为4.6±1.2和14.4±2.1(n=6),与未转染的对照组Ca2+释放和Ca2+内流分别为5.3±1.8和15.0±2.6(n=6)相比均没有显著性差异。　　 3.沉默EndophilinⅡ后1umol.L-1 BayK8644引起的Ca2+内流量为21.9±2.6明显高于对照组的Ca2+内流13.7±1.9(n=6,P<0.01),两者间有显著性差异。而转染negative和hyperfect组Ca2+内流分别为13.0±2.2和14.4±2.1(n=6),与对照组相比均无差异。　　 4.在1μmol.L-1 nifedipine存在的条件下,用100umol.L-1 OAG激活受体操纵性阳离子通道后,在siRNA沉默组细胞和对照组细胞,500μM Mn2+均可引起一个明显的荧光淬灭,最大的淬灭率分别为20.2±3.6％和27.8±4.1％(n=6,P<0.01),两者之间有显著性差异。而转染negative和hyperfect组最大的淬灭率分别为28.2±4.5％和29.1±4.7％(n=6),与对照组相比均无差异。　　 5.在1μmol.L-1 nifedipine存在的条件下,用1μmol.L-1 TG激活钙池操纵性阳离子通道后,在siRNA沉默组细胞和对照组细胞,500μM Mn2+均可引起一个明显的荧光淬灭,最大的淬灭率分别为44.8±3.7％和44.1±4.0％(n=6),两者之间无显著性差异。　　 6.用1umol.L-1 BayK8644激活电压依赖性阳离子通道后,在siRNA沉默组细胞和对照组细胞,500μM Mn2+均可引起一个明显的荧光淬灭,最大的淬灭率分别为28.9±2.7％和38.4±3.6％(n=6,P<0.01),两者之间有显著性差异。而转染negative和hyperfect组最大的淬灭率分别为29.2±2.9％和28.3±3.3％(n=6),与对照组相比均无差异。　　 7.胞内透析抗EndophilinⅡ抗体可以抑制ROCC电流,在钳制电位为-60mV,100μmol.L-1 OAG可激活一内向电流,胞内透析抗EndophilinⅡ抗体后的电流密度为-3.12±0.29 pA·pF-1与对照组细胞在-60mV的电流密度-5.02±0.31pA·pF-1相比,有显著性差异。而抗原预吸附抗EndophilinⅡ抗体后胞内透析对ROCC电流无明显作用。　　 8.胞内透析抗EndophilinⅡ抗体后,1μmol.L-1 TG在BASMC细胞可激活一内向电流,在-60mV的电流密度为-5.81±0.87 pA·pF-1与对照组细胞在-60mV的电流密度-5.42±0.91 pA·pF-1相比,无显著性差异。　　 9.1μmol.L-1 Bayk8644在BASMC细胞可激活一内向电流,胞内透析抗EndophilinⅡ抗体后的电流密度为-4.19±0.39 pA·pF-1与对照组细胞的电流密度-2.75±0.31pA·pF-1相比,有显著性差异(n=6,P<0.01)。但透析抗原预吸附抗EndophilinⅡ抗体后Bayk8644引起的内向Ca2+电流与对照组无明显差异。　　 小结　　 1)沉默EndophilinⅡ后减少OAG诱导的Ca2+内流,增加BayK8644诱导的Ca2+内流,对TG诱导的Ca2+内流无明显作用,2)胞内透析抗EndophilinⅡ抗体可以抑制OAG激活的ROCC电流,增强BayK8644激活的VDCC电流而对TG激活的SOCC电流无明显影响　　 结论　　 1.EndophilinⅡ能增强低渗诱导的VRCC的开放。EndophilinⅡ对VRCC的调节是通过促进C1C-3从细胞浆向细胞膜转运,增加C1C-3在膜上的表达来实现的。　　 2.EndophilinⅡ能促进ET-1或低渗溶液诱导的BASMCs的增殖及细胞周期的进程。EndophilinⅡ促进增殖的效应至少部分是由VRCC介导的。　　 3.EndophilinⅡ能增强OAG介导的ROCC,抑制bayk8644介导的VDCC而对TG介导的SOCC无明显作用