正常妊娠滋养细胞具有类似肿瘤细胞的侵袭性，但在胎盘形成后，滋养层细胞的侵袭行为便先行终止，这又与肿瘤细胞的侵袭完全不同，即所谓滋养层细胞侵入的节制性。滋养层细胞的侵入过程是受到机体严格的精细调控的，调节失控就会导致病变，其中滋养层细胞过度的侵入与多种妊娠滋养细胞疾病（如绒毛膜癌等）形成有关，而侵入不足则会造成自然流产、宫内发育迟缓、先兆子痫等。因此，阐明滋养层细胞的侵袭机制将为防治滋养层细胞侵入异常相关的疾病提供理论基础。胚胎的滋养层细胞与子宫内膜细胞接触，启动粘附、迁移、基质降解、侵蚀母体血管及新生血管生成、侵袭子宫内膜等信号级联反应。如同肿瘤一样，滋养层细胞的转移能力也包括粘附、侵袭和迁移三个过程，影响其中的任一环节均有可能影响滋养层细胞侵入。绒毛膜癌是继发于正常或异常妊娠之后的滋养细胞肿瘤，恶性程度极高，其危害主要在于转移发生早且广泛，严重影响了患者的生存率。如能早期提供有效、客观判断滋养细胞侵袭力的指标或标志物，则对临床工作有重大的指导意义。四分子交联体超家族，又称跨膜4超家族（transmenberance 4 superfamily，TM4SF），是一组以四次跨膜及两个大小不等的细胞外环状结构为主要特征的膜表面蛋白，在哺乳动物体内广泛表达，除了红细胞外的所有类型的哺乳动物细胞均表达一种或几种四分子交联体。四分子交联体超家族成员还可以通过彼此间的相互联系，以及同许多其它类型的膜表面蛋白的联系，共同形成四分子交联体网（tetraspanin web），调节细胞的运动、转移，激发同类型的细胞的聚集，多种类型细胞的融合，以及细胞的信号传导。越来越多的研究表明，这个家族的许多成员对恶性肿瘤的转移能力有重要影响。TM4SF9是四分子交联体超家族的一员，它可以与多种生长促进分子和粘附分子结合，对恶性肿瘤的转移能力也有重要影响。目前对TM4SF9的研究，主要集中在神经系统，它在神经系统中高表达，可以影响小鼠的神经细胞及神经胶质细胞的粘附、运动和增殖。关于TM4SF9在滋养细胞中的表达及其作用，国内外尚未见报道。为了解TM4SF9的表达是否与滋养细胞的侵袭相关，滋养细胞的侵袭力是否可以调控，本研究用免疫组化技术检测TM4SF9蛋白在正常早孕、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌中的表达，继而利用先进的RNAi技术阻断TM4SF9基因在绒癌JEG-3细胞中的表达，建立TM4SF9表达水平稳定下调的JEG-3细胞株，并观察绒癌JEG-3细胞侵袭行为的变化，试图从分子和细胞水平深入探讨该基因对滋养细胞疾病发病的影响，不仅有利于阐明滋养细胞疾病发病的分子机制，也希望为临床上诊断、治疗及预后判断寻找有效、客观的标志物，并探索滋养细胞疾病潜在的治疗靶点。第一章TM4SF9蛋白在早孕绒毛，葡萄胎，侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌中的表达【目的】为了解四分子交联体家族成员9（TM4SF9）蛋白是否与滋养细胞的侵袭力有关，我们检测了其在早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎及绒毛膜癌四种侵袭、转移能力不同的滋养细胞中的表达，探讨其意义。【方法】1．实验分组：正常早孕绒毛30例，葡萄胎20例，侵蚀性葡萄胎11例，绒癌6例。2．应用免疫组化方法检测TM4SF9蛋白在早孕绒毛，葡萄胎，侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌中的表达情况。3．结果判断：细胞膜着棕黄色为阳性，按照Julia H．Carter等人的方法，根据染色强度和显色细胞的比例进行综合评分。【结果】1．TM4SF9蛋白在正常早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌中均有表达。在正常早孕绒毛中的表达率为90.0％（27／30），在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌中的表达率均为100％（20／20，11／11，6／6）；从正常早孕绒毛到葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌强阳性表达率逐渐增高（0，10％，36.4％，100％）。2．TM4SF9蛋白的表达部位主要在增生活跃、执行侵袭功能的滋养细胞：1)在早孕绒毛，TM4SF9蛋白表达于绒毛的细胞滋养细胞，以及执行侵袭功能的滋养细胞柱远端侵入蜕膜及其螺旋动脉、绒毛毛细血管内的绒毛外细胞滋养细胞（extravillous cytotrophoblasts，EVCT）的细胞浆和细胞膜，且在EVCT细胞中的表达明显增强，在增生不活跃合体滋养细胞无表达；2)在葡萄胎，TM4SF9蛋白表达于增生过度的葡萄胎水泡的胞质和胞膜，部分性葡萄胎的绒毛部分未见表达；3)在侵蚀性葡萄胎，TM4SF9蛋白强表达于葡萄胎水泡及侵入子宫肌层和血管内的滋养细胞。也提示TM4SF9蛋白表达于增生活跃及执行侵袭功能的滋养细胞；4)在绒癌，TM4SF9蛋白广泛强表达于胞质和胞膜。3．TM4SF9蛋白的表达强度：TM4SF9蛋白在早孕绒毛（-～++）、葡萄胎（+～+++）和侵蚀性葡萄胎（+～+++）、绒癌（+++）中的表达依次显著增强（P＜0.05），在绒癌中全部呈强阳性表达。显示TM4SF9蛋白主要在恶性或侵袭力强的细胞中表达。【结论】TM4SF9蛋白主要表达于母胎介面具有侵袭性的绒毛外滋养层细胞以及增生活跃、执行侵袭功能的滋养细胞，随着增生程度、侵袭性的增强，TM4SF9蛋白在正常早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎，绒癌中的表达逐渐增强，强烈提示，TM4SF9蛋白的表达与滋养细胞的侵袭、转移性相关。第二章稳定表达TM4SF9／shRNA的绒癌细胞株的建立与鉴定【目的】第一部分的研究发现在滋养细胞中均有TM4SF9蛋白表达，转移能力强的绒癌中TM4SF9表达水平相对上调，全部呈强阳性表达。为了进一步研究TM4SF9是否对滋养细胞的侵袭、转移性等相关生物学行为有影响，本研究第二部分试图利用表达水平相对较高的JEG-3绒癌细胞株，通过RNAi技术下调其中TM4SF9的表达水平，继而建立TM4SF9表达水平稳定下调的JEG-3细胞株，为进一步的研究打下基础。【方法】1．细胞培养：JEG-3绒膜癌细胞株在37℃50ml／L CO₂条件下，培养于含10ml／L新生牛血清、100KU／L青霉素、100mg／L链霉素的RPMI-1640中，每周传代2次。2．用RNAi技术下调JEG-3绒癌细胞株中TM4SF9的表达水平1)构建表达shRNA的重组GPU6／GFP／Neo-shRNA质粒：设计4段TM4SF9的shRNA片段，1段无意义的干扰片段做对照，1个GAPDH干扰片段用于检测干扰效果。shRNA模板中的loop结构选用TTCAAGAGA，shRNA的转录终止序列采用T6结构。酶切位点选择BbsⅠ（上游）和BamHI（下游）。2)鉴定表达shRNA的重组GPU6／GFP／Neo-shRNA质粒：所得质粒用BamHⅠ，、PstⅠ分别酶切鉴定，阳性重组载体应该可以被BamHⅠ切开，而不能被PstⅠ切开。进一步将重组成功的质粒测序。3)重组质粒转染JEG-3细胞株：用脂质体法将重组质粒导入JEG-3细胞。转染后的JEG-3细胞株，按shRNA干扰片段的起始位点表示为：无意义干扰片段转染组（Tspan5／N），Tspan5／922组，Tspan5／372组，Tspan5／453组。4)干扰效果的鉴定：分别用real-time PCR和Western-Blotting技术检测转染重组质粒的JEG-3细胞中TM4SF9的mRNA和蛋白质的表达量，鉴定干扰效果。【结果】1．表达shRNA的重组GPU6／GFP／Neo-shRNA质粒的单酶切鉴定：用BamHⅠ，、PstI分别酶切鉴定，重组载体可以被BamHⅠ切开，而不能被PstⅠ切开，酶切结果与预期相符，进一步的测序也提示重组成功。2．稳定表达TM4SF9／shRNA的JEG-3细胞系建立：重组质粒转染48h后用G418 1000μg／ml筛选JEG-3细胞，2周后出现各重组质粒转染的单细胞克隆群落，挑选单克隆细胞群落继续培养，5周后细胞生长速度明显加快。说明细胞系建立成功。3．TM4SF9干扰效果的确定a) Real-time PCR鉴定结果：与未行干扰的对照组JEG-3细胞TM4SF9表达量（3.03）相比，无意义干扰片段转染组（Tspan5／N）（4.14）基本相等，Tspan5／922组（2.69）下降11％，Tspan5／372组（1.14）下降62％，Tspan5／453组（0.56）下降81％。结果显示：shRNA干扰片段起始位点在453和372的两株转染细胞干扰效果最明显，TM4SF9的mRNA表达量明显下降，选这两组细胞进一步检测。b) Western-Blotting鉴定结果：TM4SF9相对表达量从低到高依次为Tspan5／453＜Tspan5／372＜Tspan5／N，说明shRNA干扰片段起始位点在453和372的两株转染细胞干扰效果明显，TM4SF9的蛋白质表达量下降。【结论】成功构建稳定表达重组TM4SF9-shRNA质粒的JEG-3细胞系，Real-timePCR和Western-Blotting技术检测干扰效果，证明干扰有效，其中shRNA干扰片段起始位点在453和372的两株转染细胞干扰效果尤为明显，继而成功建立2株TM4SF9表达水平稳定下调的JEG-3细胞株。既为进一步的研究打下了基础，也为绒癌在基因功能的测定方面开辟了新的思路。第三章TM4SF9表达水平对绒癌细胞株转移相关生物学行为的影响【目的】为进一步了解TM4SF9的表达是否与滋养细胞的侵袭有关，滋养细胞的侵袭力是否可以调控，我们利用前一部分研究建立的TM4SF9表达水平稳定下调的JEG-3细胞株，了解TM4SF9表达水平下降对绒癌细胞侵袭、转移相关生物学行为的影响。【方法】1．细胞培养：Tspan5／N、Tspan5／372和Tspan5／453组JEG-3在37℃50ml／L CO₂条件下，培养于含10ml／L新生牛血清、100ku／L青霉素、100mg／L链霉素的RPMI-1640中，每周传代2次。2．异质粘附实验：待测细胞分3组，分别为Tspan5／N、Tspan5／372、Tspan5／453组，每组设24个孔。粘附介质选择collagenⅠ，粘附时间为1小时。2．1．1趋化运动试验：待测细胞分3组，分别为Tspan5／N、Tspan5／372、Tspan5／453组，每组设4个孔。用NIH3T3细胞培养上清做为趋化液，细胞培养10小时后观察结果。【结果】TM4SF9表达水平改变对绒癌细胞株转移相关生物学行为的影响1．异质粘附实验：Tspan5／N粘附细胞数多于Tspan5／372和Tspan5／453，P＜0.001，Tspan5／372粘附细胞数多于Tspan5／453，P＜0.001。说明下调TM4SF9表达水平后，JEG-3细胞株异质粘附性减弱。2．趋化运动性实验：Tspan5／N穿孔细胞数多于Tspan5／372和Tspan5／453，P＜0.001，Tspan5／372穿孔细胞数与Tspan5／453相比无显著差异，P=0.358。说明下调TM4SF9表达水平后，JEG-3细胞株异质运动性减弱。【结论】下调TM4SF9表达则可以减弱绒癌细胞株的粘附性和运动性。说明TM4SF9基因可以影响绒癌细胞的粘附性和运动性。TM4SF9有望成为反映绒毛膜癌的侵袭力的标志蛋白，为临床治疗和预后判断提供帮助。全文小结1．本研究首次发现了在正常早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌中均表达TM4SF9蛋白。2．TM4SF9蛋白定位于增生活跃和执行侵袭功能的细胞滋养层细胞，随着增生程度、侵袭性的增强，TM4SF9蛋白在正常早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎，绒癌中的表达逐渐增强，推测TM4SF9蛋白的表达强度可能与滋养细胞的增生、侵袭和转移能力相关。3．应用RNAi技术成功建立2株TM4SF9表达水平稳定下调的JEG-3细胞株。4．通过改变绒癌细胞株TM4SF9的表达发现该基因可以影响绒癌细胞的粘附性和运动性。TM4SF9有望成为反映绒毛膜癌的侵袭力的标志蛋白，为临床治疗和预后判断提供帮助。总之，本研究的结果支持TM4SF9与绒癌细胞的转移能力有关。