论文部分内容阅读
目的：通过使用靶向质粒,siRNA转染的方法,干预人肝癌细胞系Huh-7细胞中Wip1基因的表达,使其表达分别上调及下调。在验证Wip1基因被干预以后,观察Huh-7细胞在wipl蛋白表达、增殖能力、迁移能力、侵袭能力等细胞生物学特性方面的变化。初步探讨导致Huh-7细胞发生细胞生物学特性变化的原因及机制,为后期的动物实验提供理论支持,为肝癌的临床治疗、干预提供一种新的方法及思路。方法：通过转染试剂NanoFection Transfection Reagent (ExCell)的介导,分别将靶向Wip1基因的质粒及siRNA转染入人肝癌细胞株Huh-7细胞。靶向Wip1基因的质粒能够上调Wip1基因表达,而siRNA则通过介导wip1相关mRNA的降解从而下调Wipl基因的表达。在转染完成24h后,行PCR实验,验证Huh-7细胞内Wip1基因mRNA的表达量的是否发生了变化。若其表达量有变化,则在转染完成48h后,行Western blot实验,检测Huh-7细胞内wip1蛋白的表达量有无变化；转染完成24h后,行CCK-8细胞增殖-毒性检测实验,检测Huh-7细胞在24h、48h、72h三个时间段内细胞的增殖能力有无变化；转染完成24h后,行细胞划痕实验,检测Huh-7细胞在24h、48h、72h三个时间段内细胞的迁移能力有无变化：转染完成24h后,行Transwell细胞侵袭实验,检测Huh-7细胞在24h内的细胞侵袭能力有无变化。结果：质粒转染完成24h后,Huh-7细胞内Wip1基因mRNA的表达量较未转染时上调。质粒转染完成48h后,Huh-7细胞内wip1蛋白的表达量较未转染时上调。CCK-8细胞增殖-毒性检测实验方面,在各个时间观察段及各个细胞数量梯度中,质粒转染组在450nm处的吸光度(OD值)均较未转染组高,各个时间段及各个细胞数量梯度组的增殖率在107.42%-176.36%之间,大多集中在130%左右。细胞划痕实验方面,未转染组Hu_h-7细胞与质粒转染组Huh-7细胞在24h、48h、72h处的划痕迁移距离分别为：34.78±4.77 μmVS61.60±2.02 μ m(t=8.97,P<0.05)；33.98±3.48 μm VS 64.75±4.67 u m(t=9.19,P<0.05)；35.49±0.90μm VS 67.89±4.23 μm(t=13.01,P<0.05)。Transwell细胞侵袭实验方面,未转染组Huh-7细胞与质粒转染组Huh-7细胞三次Transwell实验的迁移细胞数分别为：90,00±3.00VS178.67±5.77(t=23.65,P<0.05)：74.33±26.95 VS 209.00±32.91(t=-5.48,P<0.05)：79.33±20.74 VS 208.67±73.24(t=13.01,P<0.05)。siRNA转染完成24h后,siRNA干扰组的Huh-7细胞内Wipl基因mRNA的表达量较Negative Control (NC)组的下调。siRNA转染完成48h后,siRNA干扰组的Huh-72细胞wip1蛋白的表达量较NC组的下调。CCK-8细胞增殖-毒性检测实验方面,在各个时间观察段及各个细胞数量梯度中,siRNA干扰组在450nm处的OD值均较NC组低,各个时间段及各个细胞数量梯度组的抑制率在12.37%-40.81%之间,大多集中在30%左右。细胞划痕实验方面,NC组Huh-7细胞与siRNA干扰组Huh-7细胞在24h、48h、72h处的划痕迁移距离分别为：31.24±4.42 μ m VS 16.04±6.21 μ m(t=18.53,P<0.05)：31.33±2.13 μm VS 18.20±5.67 μm(t=16.09,P<0.05)；32.45±3.08 μmVS18.99±5.32 u m(t=16.50,P<0.05)。Transwell细胞侵袭实验方面,NC组Huh-7细胞与siRNA干扰组Huh-7细胞三次Transwell实验的迁移细胞数分别为：74.00±12.17 VS 33.00±10.44(t=14.91,P<0.05)；77.00±5.00 VS32.67±2.08(t=22.05,P<0.05)；81.33±17.16 VS 29.30±2.51(t=20.32,P<0.05)。结论：经过靶向Wip1基因的质粒转染后,人肝癌细胞株Huh-7细胞内Wip1基因mRNA的表达水平上调,wip1蛋白的表达水平上调,增殖能力增强,迁移能力增强,侵袭能力增强。经过靶向Wip1基因的siRNA转染后,人肝癌细胞株Huh-72细胞内Wip1基因]mRNA的表达水平下调,wip1蛋白的表达水平下调,增殖能力被抑制,迁移能力被抑制,侵袭能力被抑制。