论文部分内容阅读
MESP2（Mesodermal Posterior 2）是一种具有碱性螺旋-环-螺旋（b HLH）基序的转录因子,在哺乳动物体节和心脏的发育过程中发挥关键作用。MESP2是体细胞形态发生中多个过程的调控因子,在Notch信号通路的控制分割程序中也发挥了重要功能。事实上,边界的形成和部分区域的划分依赖于Wnt和Notch信号的共同作用。这两种途径的中断都会抑制体节形成和MESP2的蛋白表达,而MESP2的蛋白水平指示体节的分区化和边界形成。前期功能实验表明,b HLH转录因子的异常表达与多种肿瘤发生有关。这些发现表明MESP2可能与人类癌症进展相关。胃癌（Gastric cancer）是一种致命的恶性肿瘤,是全球人类癌症死亡的第三大主要原因,每年导致约723000人死亡。胃癌患者生存期较差,主要是由于治疗不佳和诊断较晚。TCF4（Transcription Factor 7-like 2）是Wnt信号通路的关键组成部分,作为转录因子主要在细胞核内发挥作用。此外,Wnt配体可以触发典型的Wnt/beta-catenin信号通路,进而激活LRP和Frizzled受体,促进beta-catenin稳定和核易位。随后,核beta-catenin与TCF4结合,调控下游基因转录。典型的Wnt信号传导至beta-catenin通路的功能目标是TCF4/beta-catenin复合物的形成,这种相互作用被认为是治疗癌症的有效靶点。在本文中,我们利用分子生物学、细胞生物学、分子病理学等技术,探究了MESP2在胃癌细胞中的分子机制,阐释了MESP2抑制胃癌进程的作用,主要研究结果有:（1）MESP2低表达与胃癌患者的不良预后相关。我们首先检测了MESP2蛋白在胃癌细胞中的定位。通过免疫组化实验分析了80例临床患者的MESP2表达水平。与正常组织相比,胃肿瘤组织中MESP2染色明显低于正常组织,且呈级别依赖性。同样,使用R2数据库对胃癌患者肿瘤中MESP2表达水平的进行分析,发现MESP2表达上调后病人生存率高。这提示MESP2可能是一种抑癌基因。（2）MESP2抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。我们在HGC-27和MKN-45细胞中用慢病毒介导的sh MESP2#1和sh MESP2#2下调了MESP2的表达。MTT和Brdu实验表明干涉MESP2表达后可以显著促进胃癌细胞的生长。过表达MESP2则相反。流式细胞仪周期分析显示MESP2表达上调后细胞周期进程明显被阻滞在G0/G1期。此外Transwell实验和划痕实验显示下调MESP2表达后细胞的迁移侵袭能力显著增强。小鼠细胞株异种移植瘤模型和体内肺转移实验也证实了上述结果。（3）MESP2通过与beta-catenin竞争性结合TCF4进而抑制TCF4/beta-catenin转录复合物的活性。通过功能域分析,我们发现ITF2和MESP2蛋白有一段相对保守的b HLH结构域。而在线网站预测评估了MESP2和TCF4之间存在结合。免疫荧光和Co-IP检测进一步证实MESP2和TCF4的结合情况。截短实验确定两者结合的具体区域分别为bHLH和beta-catenin结合域。核质分离实验表明下调MESP2表达后细胞核中TCF4的含量显著增加。基于MESP2与beta-catenin无结合,我们检测到MESP2过表达显著抑制了beta-catenin与TCF4的结合。双荧光素酶报告基因检测显示MESP2过表达后TCF4转录因子活性降低。（4）MESP2调控SKP2启动子的转录活性及随后p27的泛素化降解进而抑制胃癌进程。WB和q RT-PCR实验表明MESP2下调后p27 m RNA水平没有显著变化,但p27蛋白水平降低。说明p27表达水平的改变与转录后机制相关。CHX实验显示MESP2过表达显著延长了p27蛋白的半衰期。同样,MG132处理阻断了下调MESP2表达诱导的p27蛋白降解。此外,体外泛素化实验显示,下调MESP2可增强p27的多聚泛素化作用。转录组数据分析显示下调MESP2表达抑制了p27相关通路。Ch IP实验说明TCF4可以与SKP2启动子结合。而MESP2过表达显著抑制了TCF4与SKP2启动子的结合。双荧光素酶报告基因检测显示,与对照组相比,转染TCF4提高了SKP2报告基因的荧光素酶活性。共转染MESP2和TCF4后,SKP2报告基因的荧光素酶活性明显受到抑制。我们检测到下调SKP2表达可以抑制下调MESP2表达促进的细胞增殖迁移能力。同时相关蛋白表达水平部分抑制。以上结果说明过表达MESP2导致p27的积累可能是由于抑制了TCF4/beta-catenin复合物介导的SKP2转录。总之,我们首次报道了MESP2是一种全新的胃癌抑制因子。从机制上讲,MESP2与beta-catenin竞争性结合TCF4,抑制TCF4/beta-catenin复合体在SKP2启动子上的转录激活活性,进而抑制p27的泛素化提高其稳定性和表达水平。因此,本研究揭示了MESP2抑制胃癌细胞中增殖、迁移和侵袭的新作用,说明MESP2是胃癌患者的一个前瞻性治疗靶点。