论文部分内容阅读
目的研究circCHFR对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、迁移、炎症及氧化应激的影响;从分子生物学水平验证circCHFR调控VSMCs生物学行为的机制,深入探讨circCHFR/mi R-214-3p/Wnt3/β-catenin途径在ox-LDL诱导的VSMCs增殖、迁移、炎症及氧化应激反应中的调控机制。方法运用ox-LDL诱导VSMCs构建动脉粥样硬化细胞模型。实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测circCHFR相对表达水平;核糖核酸酶R（RNase R）酶切实验和RNA核浆分离实验明确circCHFR的稳定性及核质定位;通过MTT实验和平板克隆实验检测circCHFR对细胞增殖活力的影响;通过流式细胞仪检测circCHFR对细胞周期的影响;通过Transwell小室实验检测circCHFR对细胞迁移能力的影响;采用酶联免疫吸附法（ELISA）法检测circCHFR对细胞分泌炎性因子的影响;试剂盒法检测细胞内活性氧（ROS）水平,同时检测超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）活性。通过q RT-PCR和蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测circCHFR对细胞中Wnt3表达的影响;通过MTT实验、平板克隆、流式细胞仪、Transwell小室实验检测Wnt3对ox-LDL诱导的细胞增殖和迁移的影响,ELISA法检测Wnt3对ox-LDL诱导的细胞分泌炎性因子的影响,试剂盒法检测Wnt3对ox-LDL诱导的细胞氧化应激的影响;通过生物信息学分析预测结合位点、双荧光素酶报告实验及q RT-PCR明确circCHFR直接靶向mi R-214-3p;通过生物信息学分析预测结合位点、双荧光素酶报告实验、q RT-PCR及Western blot明确mi R-214-3p直接靶向Wnt3;通过MTT实验、平板克隆、流式细胞仪、Transwell小室和ELISA实验明确mi R-214-3p和Wnt3对circCHFR作用的影响,并通过Western blot检测circCHFR/mi R-214-3p/Wnt3是否对下游β-catenin存在影响。结果与对照组比较,ox-LDL诱导VSMCs中circCHFR表达升高;RNase R酶切实验和RNA核浆分离实验结果表明circCHFR对RNase R酶具有耐受性,且主要定位于细胞质;敲减circCHFR逆转ox-LDL诱导的VSMCs增殖、迁移、炎症及氧化应激反应。在VSMCs中敲减circCHFR时,抑制Wnt3基因表达;敲减Wnt3能够逆转ox-LDL诱导的VSMCs增殖、迁移、炎症及氧化应激反应;circCHFR与mi R-214-3p靶向结合,双荧光素酶报告实验结果显示共同转染p GL3-circCHFR和mi R-214-3p mimics组细胞中荧光素酶活性显著降低;ox-LDL诱导VSMCs中mi R-214-3p表达降低,在VSMCs中敲减circCHFR时,促进mi R-214-3p表达;mi R-214-3p与Wnt3的3’UTR靶向结合,双荧光素酶报告实验结果显示共同转染p GL3-Wnt3 3’UTR和mi R-214-3p mimics组细胞中荧光素酶活性显著降低;在VSMCs转染mi R-214-3p mimics后,Wnt3 m RNA和蛋白表达均降低,转染mi R-214-3p inhibitor后,Wnt3 m RNA和蛋白表达均升高;与ox-LDL+si-NC组比较,ox-LDL+si-circCHFR#1组细胞增殖和迁移能力降低,细胞培养上清液中炎性因子浓度较少,细胞内ROS水平降低,SOD和Gpx活性增强,细胞中Wnt3 m RNA及Wnt3、nuclearβ-catenin蛋白表达降低,p-β-catenin蛋白表达升高;与ox-LDL+si-circCHFR#1+anti-mi R-NC组比较,ox-LDL+si-circCHFR#1+anti-mi R-214-3p组细胞增殖和迁移能力增强,细胞培养上清液中炎性因子浓度升高,细胞内ROS水平升高,SOD和Gpx活性降低,细胞中Wnt3 m RNA及Wnt3、nuclearβ-catenin蛋白表达升高,p-β-catenin蛋白表达降低;与ox-LDL+si-circCHFR#1+pc DNA组比较,ox-LDL+si-circCHFR#1+Wnt3组细胞增殖和迁移能力增强,细胞培养上清液中炎性因子浓度升高,细胞内ROS水平升高,SOD和Gpx活性降低,细胞中Wnt3m RNA及Wnt3、nuclearβ-catenin蛋白表达升高,p-β-catenin蛋白表达降低。结论CircCHFR在ox-LDL诱导的VSMCs中表达升高,敲减circCHFR能够逆转ox-LDL诱导的VSMCs增殖、迁移、炎症及氧化应激;circCHFR对VSMCs增殖、迁移、炎症及氧化应激反应的调控作用是通过吸附mi R-214-3p,进而影响Wnt3/β-catenin信号通路活性实现的。