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寄生性线虫能在动物群体中造成相当高的发病率和死亡率,其中,捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是世界范围内具有重大经济意义的小型反刍动物寄生性线虫之一,无论是在发展中国家还是发达国家其流行率均居高不下。该虫感染后引起的捻转血矛线虫病（haemonchosis）能够造成宿主生长发育障碍、生产力低下,严重时亦可导致死亡,极大地威胁了反刍动物的健康,另外,高昂的防治费用也制约了畜牧业的可持续发展。虽然,目前仍有数种广谱抗蠕虫药物单独或联合用药对捻转血矛线虫感染有较好的治疗效果,但长期过度依赖这些药物使得不同地区的捻转血矛线虫对抗蠕虫药物产生了不同程度的耐药性,这将导致可用的药物越来越少。另外,由于缺乏可投入生产的疫苗,使得目前寄生性蠕虫的防控形势极为严峻。因此,寻找新的关键药物靶位及疫苗候选基因,开发无污染、无残留的新型药物和研制安全、高效的疫苗是目前线虫病防治的重要研究方向。丝氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitors,SPIs）在寄生性线虫寄生阶段高表达,是其长期与宿主相互作用的进化表现,可抑制宿主丝氨酸蛋白酶从而保障自身生存需要和逃避宿主的杀伤机制。明确SPIs在寄生虫-宿主交互过程中的作用,能为寄生虫病的防治提供新的方向。本研究从课题组前期的蛋白质组学数据中筛选出一种在捻转血矛线虫L4期高表达的SPI,扩增获得了Hc-spi-i8a和Hcspi-i8b两个剪切体,并对其表达特性进行分析;通过血液凝固和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）实验研究Hc-SPI-I8A的功能;利用酵母双杂交、Co IP、GST pull-down和共定位技术筛选并验证Hc-SPI-I8A与绵羊含TSP1结构域蛋白（Ovis aries TSP1-containing protein,Oa TSP1CP）间的互作关系,初步分析Hc-SPI-I8A发挥抗凝血功能的机制;结合泛素化、p65入核和点突变等实验初步明确Hc-SPI-I8调控RACK1/IKKs/NF-κB/TNF-α通路的机制。研究结果为深入研究捻转血矛线虫抗凝血和抑制宿主免疫反应的机制奠定了坚实的理论基础和现实依据,同时也为新型疫苗和药物的研发提供了新的靶标。1.捻转血矛线虫Hc-spi-i8基因表达特性分析为分析捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子Hc-spi-i8的表达特性,本研究通过Blast获得Hc-spi-i8的CDS序列,结合信号肽与结构域预测以及同源性与进化树分析结果,推测Hc-SPI-I8可能发挥的功能;利用真核转染技术在HEK293T细胞中对其信号肽活性进行初步验证;通过荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR）检测该基因在不同发育阶段虫体内的转录特征;使用免疫荧光组织化学（immunohistofluorescence,IHF）呈现Hc-SPII8在虫体中的定位。结果显示,Hc-spi-i8具有两个剪切体,分别为Hc-spi-i8a和Hc-spi-i8b,两者均有一个N端的信号肽,前者在C端还有一个与吸血性寄生虫（如钩虫）高度相似的TIL结构域;两者在捻转血矛线虫寄生阶段的转录水平均显著高于自由生活阶段,且Hc-SPI-I8主要表达于虫体肠道、性腺和皮下组织,说明Hc-SPI-I8可能具有抑制宿主血液凝固的功能,为后续实验指明了研究方向。2.Hc-SPI-I8A抑制宿主凝血及其作用机制为明确Hc-SPI-I8抗凝血功能及其分子机制,本研究通过绵羊全血抗凝血实验验证其功能;截断表达Hc-SPI-I8蛋白,探究TIL结构域对Hc-SPI-I8抗凝血功能的重要性;通过酵母双杂交实验筛选羊全血中可能与Hc-SPI-I8存在相互作用的凝血相关因子;经过昆虫杆状病毒表达系统表达Hc-SPI-I8的互作蛋白Oa TSP1CP,并分析其在Hc-SPI-I8发挥抗凝血功能中的作用;利用c DNA末端快速扩增技术（rapid amplification of c DNA ends,RACE）扩增Oa TSP1CP、绵羊主要凝血因子（II、VII、X和XI）。结果显示,Hc-SPI-I8A能通过TIL结构域影响外源性和内源性途经;Hc-SPI-I8可与四种绵羊血液中的蛋白结合,其中Oa TSP1CP可能参与凝血途经且特异性结合Hc-SPI-I8A进而帮助后者干扰外源性凝血途经;RACE获得了Oa TSP1CP和绵羊凝血因子的CDS全长。综合上述结果,本研究初步解析了Hc-SPI-I8A影响外源性凝血途经的机制,为全面揭示Hc-SPI-I8A抑制血液凝固的机制奠定坚实的基础。3.Hc-SPI-I8抑制宿主TNF-α型炎症反应及其分子机制为明确Hc-SPI-I8是否能通过与Oa RACK1互作而调控NF-κB活性进而抑制TNF-α型炎症反应,本研究验证了Hc-SPI-I8、RACK1和MKRN1间的互作关系并分析RACK1与两者结合的区域;利用进化树分析和p65入核实验验证RACK1/IKKs/NF-κB通路在不同物种间的保守性;经多种实验确定Hc-SPI-I8和MKRN1对NF-κB活性的影响;明确Hc-SPI-I8和MKRN1是否通过RACK1影响NF-κB活性;经过泛素化实验确定MKRN1和Hc-SPI-I8对RACK1泛素化以及MKRN1对Hc-SPI-I8泛素化的影响,进而阐明两者及RACK1泛素化对RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应的影响。结果表明,Hc-SPII8、RACK1和MKRN1能够两两结合且RACK1结合Hc-SPI-I8和MKRN1的位置相同;RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守且Hc-SPI-I8和MKRN1能通过RACK1影响NF-κB活性;MKRN1能促进RACK1和Hc-SPI-I8泛素化,Hc-SPII8能够抑制RACK1泛素化,且两者均影响RACK1 K183和K185位点的泛素化,而这两个位点的泛素化影响了RACK1在RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应中的作用。综合上述结果表明,Hc-SPI-I8可能够通过抑制MKRN1对RACK1的泛素化进而抑制TNF-α型炎症反应,研究结果能为后续更深入探究Hc-SPI-I8抑制TNF-α型炎症反应的分子机制奠定基础。综上所述,本研究从捻转血矛线虫蛋白质组学中筛选到一种在寄生阶段显著高表达的TIL型SPI,其主要表达于肠道、性腺和皮下组织;Hc-SPI-I8A依赖TIL结构域干扰宿主外源性和内源性凝血途经且与Oa TSP1CP互作有关;MKRN1、RACK1和Hc-SPI-I8间两两互相结合且MKRN1和Hc-SPI-I8结合RACK1相同的区域,RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守,且MKRN1和Hc-SPI-I8通过作用于RACK1的两个关键泛素化位点进而影响其在RACK1/IKKs/NF-κB通路中的功能。研究结果不仅进一步揭示了捻转血矛线虫抑制宿主凝血和炎症反应的机制,也为捻转血矛线虫新型药物开发和疫苗研制提供了新的靶位点。