粪肠球菌是一种条件性致病菌,可导致人和动物感染、死亡。近年来粪肠球菌感染日益严重且与其他病原微生物的混合感染也逐渐增多,但其致病机制还不清楚,尤其是与其他病原体之间的相互作用机制还处在初始研究中。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌也是常见的人及动物致病菌,三种细菌与粪肠球菌混合感染的病例也多有报道,但这三种细菌对粪肠球菌致病机制的影响尚不清楚,特别是在体内的复杂环境中如何作用的,还需要进一步研究。本试验利用小鼠的腹膜炎模型,分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌进行体内共感染,通过观察粪肠球菌在腹腔液、脾脏、肾脏和肝脏四个不同位置的生长曲线变化、粪肠球菌相关毒力基因的变化情况以及通过转录组高通量测序分析转录组的变化情况,以期为研究粪肠球菌在体内混合感染时的作用机制打下基础。生长特性影响我们通过比较粪肠球菌N41小鼠腹腔单独感染与共感染时在腹腔液、脾脏、肾脏和肝脏四个部位的生长特性变化情况,以及共感染时金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌对粪肠球菌N41生长特性的影响。我们将共感染后N41的生长曲线与单独感染时N41的生长曲线相比较,总体发现,共感染后三种细菌在小鼠腹腔的四个部位均对N41菌株的生长有一定的作用,其中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌在腹腔液、脾脏、肾脏和肝脏四个部位均能促进N41的生长,而金黄色葡萄球菌仅能在腹腔液和肾脏中促进N41的生长。具体分析,在腹腔液中,三种细菌均能促进N41的生长,使菌体浓度约升高2～3倍,此外,在时间上金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7还使N41的整个生长曲线对数期推迟了2个小时;在肝脏中,大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌均能促进N41生长,使菌体浓度分别上升了57倍和44倍,而N41与金黄色葡萄球菌共感染后的菌体浓度与单独感染时相近;在脾脏中,大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌均能促进N41的生长,使菌体浓度约升高了3～5倍,在时间上仅大肠杆菌O157:H7使生长曲线对数期推迟了2个小时,而金黄色葡萄球菌对N41略有抑制;在肾脏中,分别与三种细菌共感染后N41的菌体浓度与单独感染时相近,但在时间上,共感染后金黄色葡萄球菌能使N41的对数期推迟8个小时,大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌使N41的对数期推迟了4个小时。毒力基因mRNA水平影响依据粪肠球菌在腹腔液中的生长曲线,提取粪肠球菌N41单独感染时对数中期(ML)的总RNA,以及粪肠球菌N41与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7共感染时对数前期(EL)、对数中期(ML)和对数后期(LL)的总RNA。根据粪肠球菌V583的基因序列(Gen Bank上搜索得到)设计26种毒力基因的引物,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR测定26种毒力基因的转录量。我们将N41单独感染时26种毒力基因的转录水平与共感染时相比较,结果显示:与单独感染时相比,在ML时期,共感染后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7均能提高粪肠球菌ebp B、rnj B、Cyl L-L、Cyl L-S、gel E、spr E、efa A和fsr B这8种毒力基因的转录水平,但ebp A、ebp C、Cyl I、Cyl R1、Cyl R2、AS、Sly A和fsr A这8种毒力基因的转录量均无明显变化。除此之外,金黄色葡萄球菌还能显著提高fsr C、Cyl M、Cyl B、Cyl A、ace、rpo N、psr和atn 8种毒力基因的转录量,但大肠杆菌O157:H7仅能提高ebp R的转录量。Gel E、Spr E和Efa A对肠球菌生物被膜的形成具有一定的作用,且Gel E又能增强粪肠球菌的传播感染能力,Efa A还可以促进心内膜炎疾病的发生。本试验中两种细菌均可以提高gel E、spr E与efa A的转录量,则有可能也会促进N41生物被膜的形成并增强N41的感染能力。同时金黄色葡萄球菌还可以提高ace的转录水平,而ace编码的胶原蛋白黏附素可以促进粪肠球菌的定植黏附。总体表明在动物体内金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O175:H7均能促进粪肠球菌N41多种毒力基因的转录,同这两种菌共感染可能会增加粪肠球菌的致病性。分析共感染后EL、ML和LL三个时期各毒力基因的转录水平,发现N41与金黄色葡萄球菌共感染时ebp B、ebp C、rnj B等19种毒力基因在ML时期的转录水平最高,此外,ebp A和esp的转录量在EL、ML和LL三个时期依次递减,而ebp R、Cyl I、fsr A、sly A和AS的转录量在三个时期无显著性差异。gel E、spr E、rnj B、ace与efa A等基因可以促进粪肠球菌生物被膜的形成,并增强其存活和感染能力。由此说明在动物体内与金黄色葡萄球菌共感染时,粪肠球菌N41多数毒力基因在ML时期的转录量最大,而此时的致病力可能最强。N41与大肠杆菌O175:H7共感染时ebp A、ebp B、ebp C、rnj B、esp、atn等16种毒力基因在ML时期转录水平最低,到LL时期又有所升高,而ebp R、Cyl L-L和Cyl L-S的转录量在三个时期依次递增,ace的转录量在三个时期依次递减,其余的毒力基因变化不显著。ace的递减可能是由于N41在与大肠杆菌O175:H7共感染时,ace编码的胶原蛋白黏附素主要作用是定植黏附,因此在EL时期作用较强。说明在动物体内共感染时两种细菌对N41的作用特点有所不同,特别是在作用时间上有较大差异,在N41与大肠杆菌O175:H7共感染时,N41多数毒力基因的转录水平在对数中期受到了一定程度的抑制。转录组水平影响为探索粪肠球菌除毒力基因之外的致病基因,我们对粪肠球菌N41菌株做体外单独培养、小鼠体内单独感染以及小鼠体内与金黄色葡萄球菌共感染三种处理。然后,我们分别选取处于对数中期的三种条件下的粪肠球菌,通过转录组高通量测序,比较粪肠球菌的转录组水平变化。通过比较发现:体内单独感染的粪肠球菌N41与体外培养的粪肠球菌N41在转录组水平共检测到了3083个基因,其中有1054个差异基因,与体外培养时的N41相比,体内单独感染时有75%的差异基因显示为上调,包括代谢过程(302/402:表示共有402个差异基因,其中302个为上调)、膜(87/104)、细胞粘附(4/5)、细菌的防御应答(4/4)、发病机理(2/4)等方面的基因。这些上调的基因如糖基转移酶家族、碱性磷酸酶3、甲基接受趋化蛋白等可能会通过促进细菌的黏附定植或通过破坏感染宿主体内的正常机能来促进细菌的感染。说明粪肠球菌为在体内存活并感染,在转录组水平所做出了相应的调整,也表明体内的复杂环境会对粪肠球菌造成了巨大的影响。同时,我们发现在体内与金黄色葡萄球菌共感染的粪肠球菌N41与单独感染时的粪肠球菌N41在转录组水平共检测到了3083个基因,其中有582个差异基因,与单独感染时的N41相比,共感染时仅有25%的差异基因显示为上调包括代谢过程(47/230)、膜(17/63)、细胞杀伤(1/1)、解毒作用(1/1)等方面的基因,这些上调基因如棒状决定蛋白Mre C、细菌萜醇葡糖基转移样蛋白等可能会通过对细菌或感染宿主作用而促进N41的存活与感染,而较多的下调基因如糖基水解酶、沉默信息调节蛋白Sir2等可能受到了金黄色葡萄球菌的抑制作用,也可能是因为两种细菌在艰难的体内环境下竞争性存活,而使较多基因的转录受到了抑制。