高尿酸血症是由于体内嘌呤代谢异常或尿酸排泄障碍而引起的体内血尿酸浓度过高的一种状态,一般以尿酸合成增多或是排泄减少从而引起体内尿酸积聚为特征。如果体内血尿酸长期处于超饱和的状态,则尿酸盐晶体容易从血液中析出,在关节、软组织和肾脏等部位堆积,形成痛风。高尿酸血症的发病与经济发展程度密切相关,而且近年来呈年轻化趋势,其严峻程度不容忽视。尿酸合成途径对人体内尿酸水平的影响极其重要,而黄嘌呤氧化酶是嘌呤代谢合成尿酸的一大关键限速酶,目前市场上许多用于高尿酸血症的抑制尿酸生成药物均以黄嘌呤氧化酶为靶点。复方土茯苓颗粒来源于经验方泄浊除痹方,是专门用于治疗高尿酸血症和痛风的中药方剂。此前课题组已对该制剂进行了多方位的机制探讨,而本课题就复方土茯苓颗粒对黄嘌呤氧化酶的抑制作用进行研究。目的：本课题通过文献综述研究与实验研究两大章节就复方土茯苓颗粒对高尿酸血症黄嘌呤氧化酶的抑制作用进行探讨,其中实验部分包括动物实验和体外细胞实验,希望借此继续阐明复方土茯苓颗粒治疗高尿酸血症的多靶点机制,为该颗粒剂在临床推广使用提供证据支持,对中医治疗高尿酸血症和对高尿酸血症的中药新药开发提供基础。方法：文献综述研究：本章分为两个小节进行综述,第一小节就国内外对高尿酸血症的发病机制、高尿酸血症与其他疾病的关系、高尿酸血症的现代西医学治疗进展、高尿酸血症的动物模型研究等内容进行文献回顾,而第二小节就高尿酸血症的古代医籍记载、高尿酸血症的中医治疗方法、中医治疗高尿酸血症的作用机制研究以及复方土茯苓颗粒的前期研究工作进行回顾,最后进行发展现状与前景分析。实验研究：(1)动物实验部分：选用48只200 g±20 g的SPF级雄性SD大鼠,适应性喂养后随机分成6组,即A空白组、B模型组、C西药对照组、D中药低剂量组、E中药中剂量组和F中药高剂量组。实验开始后,除空白组外,其余各组给予氧嗪酸钾100 mg/kg腹腔注射和次黄嘌呤500 mg/kg灌胃以诱导高尿酸血症。造模剂给药每天1次,持续至实验结束,造模共8天。在实验的第4天开始,给予造模剂0.5小时后,中药低剂量组、中剂量组和高剂量组分别按1 g/kg,2 g/kg,4 g/kg的剂量给予复方土茯苓颗粒溶液灌胃,而西药对照组则以非布司他4 mg/kg剂量灌胃,模型组与空白组仅以适量生理盐水灌胃。治疗药物每天1次,共治疗5天。整个实验持续8天。最后一次给药后通过心脏采血收集血液,剖腹收集肝脏两小块,一块快速置入液氮保存,另一块以4%多聚甲醛固定后。血液样本经过离心抽离血清进行尿酸检测,液氨保存的肝脏制成10%的组织匀浆后检测黄嘌呤氧化酶(X0)活性,甲醛固定的肝脏组织进行原位杂交检测黄嘌呤氧化酶基因表达。(2)细胞实验部分：采用SPF级250g-280 g的雄性大鼠每天灌药2次、连续5天的方法制备复方土茯苓颗粒中药血清；从模板细胞中抽取并扩增XDH基因构建到质粒pENTER中成为重组质粒pENTER-XDH,并经双酶切鉴定和测序鉴定后进行扩增和去内毒素抽提；体外培养大鼠BRL 3A肝细胞,稳定传代后,对所制得的中药血清进行细胞活性检验,然后把细胞分成6组,即空白对照组、转染对照组、空白大鼠血清组、中药血清低剂量组、中药血清中剂量组和中药血清高剂量组,把重组质粒pENTER-XDH转染到空白组以外的BRL细胞24小时后,空白大鼠血清组加入黄嘌呤溶液和空白大鼠血清,中药血清低、中、高剂量组分别加入低、中、高浓度的中药血清和黄嘌呤溶液。处理24小时后收集细胞培养液检测尿酸水平与黄嘌呤氧化酶活性,最后裂解细胞、抽提总RNA,并逆转录成cDNA后进行荧光定量PCR检测XDH-mRNA表达水平。结果：文献综述研究：(1)高尿酸血症的现代医学研究：高尿酸血症的主要特征是人体内尿酸浓度的上升,而高尿酸血症的发病机制主要包括①家庭遗传性；②体内高嘌呤状态；③嘌呤合成尿酸代谢异常；④尿酸排泄障碍。高尿酸血症的发病还与多种疾病有关系,其中包括高血压、糖尿病、冠心病与肾功能损害。西医治疗高尿酸血症的药物主要包括有抑制尿酸生成药物、促进尿酸排泄药物、尿酸酶替代剂,但使用上均有一定的副作用。高尿酸血症模型目前使用较多的为啮齿类动物及禽类动物模型,均存在一定缺陷。(2)高尿酸血症的中医学研究：高尿酸血症在古籍中没有相应病名,按其后期病机可归于痹证、历节等疾病,古籍中有相当多的相方辨证与经方记载。而现代中医工作者主要以辨病与辨证结合的方式治疗高尿酸血症,并对中药及中药复方治疗高尿酸血症的作用机制作出了大量研究。实验研究：(1)动物实验：模型组血尿酸水平要远远超过空白组,差异具有统计学意义(P<0.05),表明造模方法有效；西药对照组与模型组相比,其血尿酸水平显著降低(P<0.05),表明西药治疗有效；而中药低、中、高浓度三组中,低浓度组的血尿酸水平与模型组相比,差异没有统计学意义(P>0.05),中浓度组、高浓度组的血尿酸水平均明显低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05),表明中、高浓度组则能有效使模型大鼠血尿酸降低,其中,高剂量组血尿酸下降更明显,与西药对照组无明显差别。XO活性检测中,相比于空白组,模型组大鼠经造模诱导后,XO活性显著提高(P<0.05)。西药对照组经非布司他治疗,XO活性相比于模型组也明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),达到治疗效果；三个中药组中,中剂量组和高剂量组的XO活性相比于模型组明显下降(P<0.05),其中,高剂量组的XO活性与西药对照组的程度相当,没有明显差别(P>0.05)。原位杂交检测中,模型组的XDH-mRNA表达水平远远高于空白组,说明模型组大鼠在接受造模剂诱导后,肝脏内XDH-mRNA表达量大大增加(P<0.05)。西药组大鼠在西药非布司他干预下,XDH-mRNA表达量比模型组显著下降(P<0.05),差异具有统计学意义。中药各剂量组中,中、高剂量组则明显下降(P<0.05),其中,高剂量组与西药组没有明显差别(P>0.05)。(2)细胞实验：重组质粒pENTER-XDH进行PCR产物核酸电泳鉴定及双酶切鉴定,酶切后的插入片段与PCR产物在同一水平,这与XDH的基因长度相符,即重组质粒构建成功；CCK-8检测中,含10%胎牛血清的细胞培养基与大鼠空白血清和复方土茯苓颗粒中药血清经过对过后,差异并没有统计学意义(P>0.05),且数值极低,因此可以认为对oD值也没有太大影响,而大鼠空白血清和中药血清处理的细胞与正常细胞OD值也没有统计学差异(P>0.05),即大鼠空白血清和中药血清对细胞活性没有明显的影响；XDH-mRNA的qPCR检测中,相比于空白对照组,转染对照组的目的基因XDH-mRNA表达水平大大提高,差异有统计学意义(P<0.05),证明转染重组质粒pENTER-XDH成功,基因顺利进行遗传表达,空白大鼠血清组相对于转染对照组,XDH-mRNA基因表达水平没有明显变化(P>0.05),说明正常的大鼠血清对XDH基因的表达没有明显的影响；高剂量组与空白大鼠血清组或转染对照组比较有明显差异,并具有统计学意义(P<0.05),说明中药血清高剂量组可以明显抑制XDH基因表达水平；而中药血清中剂量组在数据上看有明显降低表达的趋势,但统计学比较没有显现出统计学意义(P>0.05),考虑与样本量有关。尿酸与XO活性检测中,空白大鼠血清组的尿酸水平明显高于空白对照组和转染对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而XO活性来说,转染对照组与空白大鼠血清组都明显高于空白对照组；转染对照组的尿酸水平与空白对照组相比没有显著差异,提示细胞因为尿酸前体物质不多,尿酸合成受到限制。各个课题的中药血清组与空白大鼠血清组相比,中药血清中剂量组与高剂量组的尿酸水平和XO活性要相对更低,差异有统计学意义(P<0.05),说明中药血清高、中剂量可以明显抑制尿酸生成和抑制XO活性。而在中、高剂量两组的对比中,高剂量组抑制作用更明显(P<0.05)。结论：复方土茯苓颗粒治疗高尿酸血症、使血尿酸下降的其中一个机制,很可能就是通过直接或间接的作用抑制肝脏中XDH-mRNA的表达水平,降低XO的活性单位,减少尿酸生成；体外实验也证实复方土茯苓颗粒中药血清可能通过抑制大鼠肝细胞中过表达的XDH-mRNA基因水平和黄嘌呤氧化酶的活性,从而降低尿酸的生成。