论文部分内容阅读
目的：在前期工作的基础上，对可能的广州管圆线虫分泌蛋白基因AC16进行克隆表达，并对其免疫学特性进行了初步验证，为开展进一步对广州管圆线虫功能蛋白的研究提供实验依据。
方法：候选基因的序列分析及生物学鉴定；候选基因的生物信息学分析；候选基因的基因结构分析；候选基因的克隆与表达；重组蛋白的免疫学鉴定。
结果：①AC16基因序列的结构特点。AC16基因ORF大小为450bp，编码149个氨基酸，预测蛋白质的分子量为16.08kDa，有一个信号肽结构（位于1～17个氨基酸）。该序列与美洲钩虫的表面相关抗原2同源（相似性为56％），将该基因暂时命名为广州管圆线虫16（16,AC16）基因；AC16的基因结构分析AC16编码基因在广州管圆线虫不同虫期的相对转录水平分析显示，AC16基因在成虫和四期幼虫期均有转录。AC16的DNA和cDNA序列经比较显示无差异，说明该基因为连续的基因。②AC16基因的克隆与表达。根据GenBank中登录号DQ445995.1的序列信息，设计PCR引物扩增AC16的全长ORF，进而获得目的基因片段并定向克隆到pET—30a（+）质粒中，经PCR、双酶切及测序确证该目的基因克隆成功。将成功构建的重组子pET—30a（+）—AC16经IPTG诱导，在较宽的温度和IPTG诱导浓度范围内都获得了很好的表达；对His亲和层析柱纯化的重组表达产物rAC16进行Western—Blot鉴定，可见到与目的分子量相一致的免疫反应条带。③rAC16的免疫学特性分析。rAC16抗原性分析纯化后的重组蛋白rAC16能被广州管圆线虫感染的大鼠血清所识别，在17kDa左右处均可见一明显的免疫反应条带，而阴性对照血清以及广州管圆线虫感染的小鼠血清在相应的位置未识别出有蛋白条带；rAC16免疫原性分析Western blot结果显示，小鼠抗rAC16免疫血清均能识别rAC16、及广州管圆线虫四期幼虫及成虫可溶性抗原中16kDa处的蛋白条带；不同宿主的感染血清对成虫蛋白组分的免疫识别广州管圆线虫适宜宿主SD大鼠的感染血清均能识别成虫和四期幼虫可溶性抗原的相应组分，而非适宜宿主小鼠的感染血清对上述抗原均不能识别。
结论：AC16是本课题组利用已构建的广州管圆线虫成虫cDNA文库和EST对策发现的一个与美洲钩虫表面相关抗原2同源的广州管圆线虫未知基因。该基因的ORF长450bp，编码149个氨基酸的分泌蛋白，预测蛋白质的分子量为16.08kDa。AC16的基因DNA序列为连续基因，无内含子。通过基因工程技术获得了AC16的重组蛋白r AC16。Western—blot和RT—PCR分析发现AC16在广州管圆线虫成虫和四期幼虫中均有表达或转录。重组AC16能被广州管圆线虫感染的SD大鼠血清识别，能诱导重组蛋白免疫小鼠产生抗AC16的特异性抗体，提示rAC16具有抗原性和免疫原性。