本研究旨在探讨督脉电针(GV-EA)在治疗全横断脊髓损伤(SCI)大鼠的过程中的特异性作用机理。通过对督脉电针治疗脊髓损伤后脊髓组织内特异性神经肽和功能蛋白的检测，从而了解电针治疗在脊髓损伤后的神经保护方面的分子机制，为祖国医学在治疗脊髓损伤时首选电针督脉建立可靠的理论基础，并在蛋白水平上为脊髓损伤提供新的治疗思路，本研究共分为三个部分。　　 第一部分：督脉电针促进脊髓损伤修复中的穴位特异性蛋白表达的实验研究　　 目的：检测督脉电针在促进脊髓损伤修复过程中的差异蛋白的表达，为督脉电针的特异性作用机制提供实验依据。　　 方法：选用体重为200～250g的SD大鼠，随机分为5组，正常对照组(normalgroup)，单纯脊髓损伤组(SCI group)，督脉电针组(GV-EA+SCI group)，夹脊电针组(Jiaji-EA+SCI group)及非穴位电针组(npa-EA+SCI group)。3组电针组大鼠在经过T10脊髓节段全横断后7d接受不同的电针治疗，每天1次，每次电针20分钟，于电针7d(新鲜取材)和30d(灌注取材)后取材。电针7d后的检测分别取损伤区及其上下各1个节段的脊髓组织，先于-80℃冻存脊髓组织，样品(组织提取液)溶解后开始进行蛋白组学的各项检测。经二维凝胶电泳、计算机图象分析与大规模数据处理以及质谱技术等步骤找出差异蛋白后，再做Western Blot、荧光免疫组化等后续实验对蛋白组学检测出的差异蛋白进行定量及定位的分析。电针30d后的大鼠取L1脊髓节段背核，切片做中性红染色和荧光免疫组化检测。　　 结果：双向电泳结果显示，与单纯SCI组和穴位对照组相比，GV-EA+SCI组大鼠脊髓组织中有4种具有神经保护作用的蛋白表达显著增高，它们分别是塌陷反应介导蛋白2(CRMP2)，膜联蛋白A5(ANXA5)，热休克蛋白27(HSP27)和脑磷脂结合蛋白1(PEBP1)。Western Blot结果进一步验证了CRMP2和ANXA5在GV-EA组的相应脊髓节段内的表达显著高于单纯SCI组和穴位对照组。免疫荧光双标法分析结果显示，这4种差异蛋白在脊髓组织内的神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞内均有一定水平的表达。同时，我们中性红染色结果显示电针治疗，尤其是督脉电针治疗能够促进脊髓损伤后L1背核神经元的存活，另外，L1背核神经元内发现有ANXA5和CRMP2两种差异蛋白的表达。　　 结论：ANXA5和CRMP2是GV-EA促进脊髓损伤修复过程中具有穴位特异性的蛋白质，ANXA5和CRMP2可能参与了督脉电针促进背核神经元存活的过程，从而发挥一定的神经保护作用。　　 第二部分：督脉电针促进脊髓损伤修复中特异性神经肽的研究　　 目的：本研究为了探寻督脉电针治疗脊髓损伤后，损伤脊髓及其邻近节段脊髓组织哪种神经肽分泌增多，且这种有一定神经保护作用的神经肽具有电针特异性。　　 方法：选用体重为200～250g的SD大鼠，随机分为5组，正常对照组(normalgroup)，单纯脊髓损伤组(SCI group)，督脉电针组(GV-EA+SCI group)，夹脊电针组(Jiaji-EA+SCI group)及非穴位电针组(npa-EA+SCI group)。3组电针组大鼠在经过T10脊髓节段全横断后7d接受不同的电针治疗，每天1次，每次电针20分钟，于电针7d后取材。对脊髓损伤处及其邻近的上下节段的脊髓进行降钙素基因相关肽(CGRP)的Western Blot和免疫荧光组织化学检测，观察相应节段脊髓组织内CGRP的含量变化。　　 结果：1.Western Blot结果显示，与SCI组相比，npa-EA组和Jiaji-EA组脊髓组织的CGRP含量都有所增高，均达到正常水平，而GV-EA组脊髓组织的CGRP含量高于正常水平，且与其它4组相比，均有统计学差异。2.免疫荧光组织化学检测结果显示，CGRP在损伤邻近节段脊髓背角的表达主要集中在第Ⅰ、Ⅱ板层，阳性反应区占脊髓背侧1/2面积的百分比在几组中的比较与Western blot结果基本保持一致。　　 结论：从实验设立SCI组、穴位对照组和非穴位对照组来看，GV-EA组脊髓CGRP的表达量都高于对照组。以上结果表明，CGRP是GV-EA治疗SCI过程中特异性表达的一种神经肽，该神经肽具有一定的穴位特异性，GV-EA可能是通过对CGRP的表达调节来激发损伤脊髓组织的结构修复和神经再生的。　　 第三部分：降钙素基因相关肽CGRP对体外受损伤的大鼠小脑颗粒神经元存活的影响　　 目的：本章实验欲通过检测CGRP对体外培养的受损伤的大鼠小脑颗粒神经元存活及其ANXA5和CRMP2表达的影响，来间接证实CGRP促进受损伤神经元存活的作用和CGRP与两种差异蛋白(ANXA5和CRMP2)之问的关系。　　 方法：出生7～8 d的SD乳鼠，小心地分离出小脑组织，经胰酶、DNA酶消化后，细胞按每毫升1.5×106个的密度接种在多聚赖氨酸包被的细胞培养板中(本实验选用的是6孔板，且孔板里放有盖玻片)，培养小脑颗粒神经元。在神经元培养至7～8d胞体成熟、突起丰富的时候，建立划痕损伤模型，损伤同时加入一定剂量(10-6M和10-7M)的CGRP，在荧光显微镜下观察细胞之前的1h加2μM calceinAM(标记活细胞)和4μM EthD-Ⅲ(标记死亡细胞)，加之后在37℃下孵育1h，然后在荧光显微镜下观察和计数，其中calcein AM标记的活细胞在镜下显绿色，EthD-Ⅲ标记的死亡细胞在镜下显红色。另外，对损伤组、加入CGRP的损伤组及正常的小脑颗粒神经元还做了ANXA5/CRMP2跟Hoechst33342的双标检测，间接反映CGRP与差异蛋白ANXA5/CRMP2的关系。　　 结果：通过对各组小脑颗粒神经元存活率的检测，结果显示，跟正常组相比，单纯损伤组神经元的存活率明显降低，不管是损伤后1h、6h还是12h组：同时加CGRP的损伤组神经元的存活率尽管远不及正常组，但是跟单纯损伤组相比从6h开始存活率已经开始增高，持续到损伤后12h仍然高于损伤组。另外，CGRP的两个剂量(10-6M和10-7M)组之间在相应时间段对神经元存活率的影响没有明显差异。经过对normal组、injury组(6h)和injury(6h)+CGRP(10-7M)组小脑颗粒神经元中ANXA5和CRMP2阳性细胞百分率的统计处理，含有10-7M CGRP的损伤组，跟injury(6h)组相比，两种蛋白的阳性细胞百分率没有明显变化。　　 结论：在GV-EA治疗SCI的过程中产生的特异性神经肽CGRP具有一定的神经保护作用，可能是通过促进受损伤神经元的存活，从而有助于神经元的轴突再生和脊髓功能恢复。神经肽CGRP和差异蛋白(ANXA5和CRMP2)之间可能没有直接的联系，两者可能分别通过不同的调节通路来实现各自的神经保护作用。