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RESP18(Regulated endocrine secretory protein,18kDa)表达水平受多巴胺受体相关药物调控,定位于内质网且在内质网远端发生降解,其分子特性与常见的内质网驻留蛋白不一样,被认为是一种和分泌途径密切相关的蛋白,主要分布于内分泌组织和神经系统。到目前为止,对其功能了解甚少,且主要集中于大鼠和人的组织器官中的表达分布以及其调节因素和调节途径,而对其在神经系统疾病的研究鲜有开展。帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元进行性丢失为特征的神经系统退行性疾病。PD的病理机制仍不十分清楚,近来研究表明因未折叠或错误折叠蛋白质的积累而造成的内质网应激(ER stress, ERS)是PD发病的重要的病理机制之一,.为了明确RESP18及其剪接体RESP18-c在PD发病中的作用与机制,我们进行了两部分的研究。第一部分我们选取了MPP+,6-OHDA, Rotenone处理多巴胺能细胞株MN9D构建PD细胞模型。实时定量PCR结果显示,MN9D细胞经150μM MPP+处理24h或150μM6-OHDA处理9h后,RESP18mRNA水平显著上升,而Rotenone(不管是急性模型还是慢性模型)处理后RESP18mRNA水平虽下调,但无统计学差异；RESP18-c mRNA水平不受药物处理影想；内质网应激标志物BiPmRNA水平在Mpp+处理的细胞模型中有升高,但无统计学差异,在6-OHDA处理的细胞模型中显著升高；凋亡分子CHOP mRNA经MPP+/6-OHDA处理后均显著升局；RESP18下游基因LIMK mRNA表达水平改变呈现出与RESP18mRNA-样的趋势。Western blot结果表明MPP+/6-OHDA处理后MN9D细胞内RESP18蛋白水平明显上升,而Rotenone给药处理并不影响RESP18表达水平的变化；Mpp+给药处理不会引起BiP和CHOP表达水平的改变而6-OHDA处理可以引起BiP和CHOP表达水平的显著上升；无论是Mpp+给药处理还是6-OHDA给药处理ERS通路中XBP1及其剪接体XBP1s表达水平均不发生改变。给予ERS诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin, TG)或衣霉素(tunicamycin, TM)处理后,BiP和CHOP的mRNA和蛋白水平均显著上升,而RESP18mRNA水平虽显著上升,蛋白表达水平却显著下降。ERS抑制药物Sal (Salubrinal)联合MPP+/6-OHDA给药处理后细胞存活率显著上升。三种神经毒性药物作用机制不一样,MPP+可启动部分ERS途径,而6-OHDA可以显著的引起BiP等ERS标志物表达水平上升,关于Rotenone的研究主要集中在氧化应激上,对ERS方面的研究鲜有报道。由以上结果,我们推断RESP18参与了PD的发病,ERS在PD的发病中发挥着重要的作用,因RESP18在PD细胞模型与ERS模型中的改变与ERS标志分子BiP不完全一致,故其作用机制又可能异于常见的ERS分子。第二部分中我们构建了干扰载体进一步探讨RESP18在PD发病中的作用,经Western blot对重组载体进行干扰效率检测,最后选取2个重组质粒：A6代表RESP18及其剪接体RESP18-c均表达下调,R13代表仅RESP18表达下调。A6组给予Mpp+处理后细胞存活率显著上升,给予6-OHDA处理后没有显著改变,R13组无论是Mpp+处理还是6-OHDA处理细胞存活率均没有明显改变。Western blot法检测BiP蛋白水平结果显示,在不给予任何药物处理后仅下调RESP18/RESP18-c水平即可引起BiP的显著上升,且A6组上升水平高于R13组；给予Mpp+处理后,与RESP18正常表达组相比,A6组BiP表达水平显著上升,而R13组虽有上升但无统计学差异；给予6-OHDA处理后,与RESP18正常表达组相比,A6组与R13组BiP表达水平无明显改变。运用DAPI核酸染色法检测细胞凋亡率,结果表明,Mpp+处理组与未给药处理组相比,细胞凋亡率没有显著性变化,而6-OHDA处理组细胞凋亡率显著上升,说明6-OHDA通过诱导细胞凋亡而选择性地损伤多巴胺能细胞,Mpp+没有此效应。进一步分析表明,给予6-OHDA处理后,与对照组相比,A6组与R13组细胞的凋亡率没有明显改变。与此同时,我们还对RESP18过表达的细胞进行了研究,MTT法检测发现无论是给予Mpp+还是6-OHDA处理,RESP18过表达组细胞的存活率明显下降,但BiP表达水平并没有改变；运用TUNEL法检测细胞凋亡率后发现,给予6-OHDA处理后,与对照组相比,RESP18过表达组细胞的凋亡率显著上升。因RESP18-c mRNA不受药物处理影响,且A6组干扰效率明显强于R13组,所以综合以上结果,我们推断RESP18表达下调后联合给予Mpp+药物处理后可能通过诱导内质网应激起到保护细胞的作用；而RESP18表达上调可加剧MPP+/6-OHDA的毒性作用而对细胞存活起到损伤作用,其作用机制与ERS没有密切的关系,有待进一步研究。