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目的：探讨针对STAT5A基因的siRNA表达载体对人肝癌细胞系HepG2细胞中STAT5A基因表达的特异性抑制作用及其对肝癌细胞凋亡的影响,为干扰STAT5基因作为肿瘤基因治疗新策略的应用提供实验依据。方法：设计2条针对STAT5A基因的RNA干扰靶序列GCTCTGAATTAGTC CTTGCTT和GCGCTTTAGTGACTCAGAAAT,合成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸,退火形成双链DNA。将pYr-2.1表达载体经BsaI酶切后电泳分离,纯化回收大片段。将退火形成的双链DNA通过T4 DNA连接酶连接到线性化pYr-2.1质粒U6启动子下游,构建重组表达质粒pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA-1和pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA-2。将重组质粒转化感受态细胞DH5α,经Kanar抗性和CCDB致死基因筛选,挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增,并抽提纯化质粒,然后将抽提的重组质粒进行Xhol单酶切和琼脂糖电泳分析,同时做测序鉴定以确定插入的干扰片段准确无误,即针对STAT5A基因的siRNA表达载体构建成功。同法构建不针对任何基因的shRNA阴性对照pYr-2.1-HK。培养HepG2细胞,待细胞生长状态良好并达到指数生长期时,于转染前一日接种于6孔板中,并设置空白细胞对照组、HK阴性对照组、STAT5A-1干扰组、STAT5A-2干扰组。用表达绿色荧光蛋白(EGFP)的pYr-2.1-EGFP以检测肝癌细胞HepG2的转染效率,以每孔脂质体7.5μl、重组质粒3μg配成转染复合物,加入各孔HepG2细胞中进行转染(空白组不加任何试剂),转染后48h质粒pYr-2.1-EGPF上带有的EGFP基因得以表达,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞所占比例,以此来判断转染效率。接着用TRIzol试剂分别提取各组细胞总RNA,并应用核酸定量分析仪及琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA样本的浓度、纯度以及完整性。以各组总RNA为模板,GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内对照进行两步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),琼脂糖凝胶电泳分析,并用灰度半定量检测各组STAT5A mRNA的相对表达量；另在转染后72h进行FITC/PI双染每组细胞后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：①重组质粒pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA-1和pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA-2经XhoI酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点,重组质粒构建成功。②以LipofectamineTM2000转染HepG2细胞后48h荧光显微镜下观察,转染效率约为65%以上③RT-PCR扩增产物凝胶电泳分析显示：各组泳道中内对照GAPDH扩增产物条带(410bp)的亮度相似,而STAT5A-1干扰组、STAT5A-2干扰组扩增产物条带(452bp)的亮度均明显弱于其它二组。灰度扫描半定量结果显示,空白细胞对照组、HK对照组、STAT5A-1干扰组、STAT5A-2干扰组HepG2细胞中STAT5A mRNA的相对表达量分别为1.038±0.013、1.053±0.016、0.353±0.014、0.450±0.012。经q检验方差分析,STAT5A-1干扰组、STAT5A-2干扰组STAT5 mRNA相对表达量分别与空白组、阴性对照组相比,分别下降66.0%和56.64%左右,差异有统计学意义(P<0.01),而空白细胞对照组与HK组之间相比,无显著性差异(P>0.05)。④通过流式细胞仪检测细胞凋亡率百分显示：STAT5A-1干扰组、STAT5A-2干扰组细胞凋亡显著,凋亡率分别为37.33%和33.93%；空白细胞对照组与HK组细胞凋亡无显著性差异。结论：①设计合成的shRNA干扰序列准确无误地克隆到pYr-2.1表达载体中,针对STAT5A基因的siRNA表达载体构、建成功。②针对STAT5A基因序列构建的RNAi体内表达载体在mRNA水平特异性地抑制HepG2细胞中STAT5A的表达。③运用RNA干扰沉默肝癌细胞中STAT5A基因表达,能诱导人肝癌细胞凋亡,可成为肿瘤基因治疗的有效方法。