论文部分内容阅读
实验中以第5代牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行研究,得到如下结果与结论:
1.用75 nmo1/L曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理供体细胞6、12和24h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测处理细胞和克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平和细胞周期。结果显示:随着TSA处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K18乙酰化水平不断增高;以75nmo1/LTSA处理供体细胞12h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(23.5%vs15.7%,p<0.05)供体细胞经TSA处理的克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平与未处理组相比差异不显著(p>0.05)。结论:TSA对核供体细胞的处理存在时间效应,75mnol/LTSA处理12h的牛胎儿成纤维细胞更易被卵母细胞重编程,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实TSA是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程。
2.以曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)作为去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。应用激光共聚焦显微镜技术,通过检测卵母细胞组蛋白H3K18乙酰强度,来探讨乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)在减数分裂Ⅰ期、Ⅱ期的活性。TSA的处理浓度为80um/L。结果显示:组蛋白H3K18乙酰荧光强度在卵母细胞减数分裂期完全消失;在TSA存在下培养成熟的卵母细胞,在减数分裂期检测到强的组蛋白H3K18乙酰化荧光强度;随后卵母细胞移入不含TSA的培养液里,3h后组蛋白H3K18乙酰荧光强度再次完全消失。结论:HAT在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期无活性,HDAC在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期有活性。
3.实验所用的细胞为第2代牛胎儿成纤维细胞。TSA的处理浓度为75nmo1/L。细胞在含TSA的培养液里培养12h后用于分析。相差显微镜下对处理组细胞形态进行了观察,TSA处理的细胞呈梭形,边界清晰,个别细胞表面有凹陷。流式细胞仪测定了TSA处理细胞和对照组细胞的细胞周期,结果显示,TSA处理后的细胞,G0/G1期细胞所占的比例上升(60.1%vs48.6%,p<0.05),S期和Gz/M期细胞所占的比例则相应降低,处理组和对照组细胞G0/G1期和S期比例间存在显著差异(P<0.05)。应用免疫细胞化学方法分析了TSA处理的细胞微管蛋白表达情况,结果显示,细胞具有良好的骨架系统,微管清晰,边缘整齐。从另一侧面反映了处理细胞的活性。结论:TSA处理12h的牛胎儿成纤维细胞形态和骨架清晰、完整。但使细胞周期发生显著性变化。