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一、研究目的隐球菌病是由隐球菌引起的真菌感染性疾病。新生隐球菌是引发该疾病的主要致病真菌之一,由于该菌特有的嗜神经性,常引起致命性的隐球菌性脑膜炎,该病治疗难度大,给社会和家庭均带来极重的经济负担。目前,在隐球菌性脑膜炎治疗中,主要以两性霉素B等抗真菌药物为主,不仅药物相关副作用大且易出现菌株耐药等问题。本文旨在通过体外和体内两个实验维度,并借助外泌体蛋白组学、转录组学等高通量组学手段,探讨外泌体中FCN2/A对巨噬细胞与小鼠抗新生隐球菌感染过程中发挥的重要功能及相关调控机制,以期为新生隐球菌所致的隐球菌病患者的免疫辅助治疗提供新的理论基础与方案。二、实验方法1、通过鼻吸入法构建新生隐球菌H99感染小鼠模型和PBS对照处理小鼠模型,提取小鼠血浆外泌体（H99-EXO:感染新生隐球菌小鼠组的血浆外泌体;PBS-EXO:PBS处理小鼠组的血浆外泌体）,首先设置不同的感染时间梯度,借助纳米流式仪对不同感染时间后的小鼠血浆外泌体进行形态鉴定;借助共聚焦显微镜验证巨噬细胞对不同小鼠血浆来源外泌体的摄取情况;将H99-EXO、PBS-EXO同小鼠巨噬细胞（Raw264.7巨噬细胞系和BMDM原代巨噬细胞）共孵育24小时后,将处理过的巨噬细胞同新生隐球菌H99标准株共孵育,通过观察巨噬细胞与新生隐球菌互作的相关表型:杀伤、吞噬、IPR（胞内增殖率）以及检测H99-EXO、PBS-EXO共孵育后的巨噬细胞细胞上清炎症因子和一氧化氮释放情况,探究H99-EXO对巨噬细胞抗新生隐球菌感染功能的影响;将H99-EXO、PBS-EXO通过腹腔注射的方式注入健康小鼠体内,24小时后感染新生隐球菌,观察小鼠生存期、组织菌落负荷（肺、脑）、HE和PAS组织染色切片（肺、脑）、组织炎症因子释放（肺、脑）,探究H99-EXO对小鼠抗新生隐球菌感染能力的影响。2、纳入隐球菌性脑膜炎患者8例,同期健康对照8例,采用血浆外泌体提取试剂盒提取隐球菌性脑膜炎患者和健康对照的血浆外泌体,借助外泌体蛋白组学,探究两者之间的差异蛋白表达情况,并通过Western-Blot验证差异蛋白FCN2在隐球菌性脑膜炎患者、健康对照血浆外泌体,以及FCN2小鼠同源蛋白FCNA在新生隐球菌感染、PBS对照处理组小鼠模型中血浆外泌体内的表达情况;H99-EXO、PBSEXO同小鼠巨噬细胞共孵育24小时,之后通过实时荧光定量PCR验证各组FCNA的m RNA表达水平;Western-Blot验证各组FCNA蛋白的表达水平,以探究H99-EXO、PBS-EXO中的FCNA是否可被巨噬细胞摄取。3、利用Lipofectamine RNA iMAX转染试剂将FCNA-阴性对照、FCNA-小干扰RNA转染至小鼠Raw264.7巨噬细胞,提取FCNA敲除、野生型小鼠的BMDM,将以上两组巨噬细胞分别同新生隐球菌H99标准株共孵育,通过观察巨噬细胞与新生隐球菌互作的相关表型:杀伤、吞噬、IPR（胞内增殖率）;检测敲减、敲除FCNA巨噬细胞细胞上清炎症因子和一氧化氮释放情况,探究FCNA蛋白对巨噬细胞抗新生隐球菌感染功能的影响;构建FCNA敲除、野生型小鼠新生隐球菌感染模型,观察小鼠生存期、HE和PAS组织染色切片（肺、脑）,探究FCNA敲除后小鼠抗新生隐球菌感染能力的影响。4、对H99-EXO、PBS-EXO共孵育的小鼠BMDM巨噬细胞及FCNA敲除、野生型的小鼠BMDM巨噬细胞进行转录组学分析,选取两组转录组学中共有的差异表达基因,使用实时荧光定量PCR对差异表达基因进行验证,以期通过探究两者之间的联系初步揭示小鼠血浆外泌体中FCNA蛋白调控巨噬细胞杀伤、吞噬新生隐球菌等功能的可能作用靶点。三、实验结果1、发现与PBS处理组相比,小鼠感染新生隐球H99模型构建14天后提取的血浆外泌体在直径和浓度上均有差异;巨噬细胞可直接摄取不同小鼠血浆来源的外泌体,且巨噬细胞外泌体摄取量与时间变化呈正相关即时间越长,摄取越多;用H99-EXO预处理的巨噬细胞较PBS-EXO预处理组,对新生隐球菌的吞噬、杀伤增强,新生隐球菌在巨噬细胞内的胞内增殖能力减弱,促炎性炎症因子释放增加,一氧化氮释放无明显差异;健康小鼠回输H99-EXO、PBS-EXO后感染新生隐球菌,回输H99-EXO的小鼠生存期延长、肺脑菌落负荷下降,脑组织中IL-10和MCP-1蛋白表达增高,肺部的损伤减轻。2、对隐球菌性脑膜炎患者、健康对照的血浆外泌体进行蛋白组学分析后,共发现158个差异蛋白,其中144个下调,14个上调。筛选出5个差异蛋白,并采用Western-Blot实验对其进行验证,最终确定本研究中以FCN2/A蛋白为主要研究对象。我们发现FCN2蛋白在隐球菌病患者的血浆外泌体中低表达,FCN2小鼠同源蛋白FCNA在新生隐球菌感染小鼠血浆外泌体中也低表达;H99-EXO、PBS-EXO同小鼠巨噬细胞共孵育后,发现两组中FCNA的m RNA表达较空白对照组（无外泌体共孵育）无明显差异,但FCNA蛋白表达均高于空白对照组,证明外泌体中的FCNA进入巨噬细胞。3、发现FCNA敲减的小鼠Raw264.7较阴性对照处理组,对新生隐球菌的吞噬、杀伤增强,新生隐球菌胞内增殖能力减弱,促炎性炎症因子释放增加且巨噬细胞抗新生隐球菌感染能力同FCNA基因敲减效率可能呈正相关;FCNA敲除的小鼠BMDM较野生型组,对新生隐球菌的吞噬、杀伤增强,新生隐球菌胞内增殖能力减弱,促炎性炎症因子释放增加。以上两组中巨噬细胞细胞上清中均无明显一氧化氮释放。构建FCNA敲除、野生型小鼠新生隐球菌感染模型,发现FCNA敲除组较野生型组,小鼠的生存期延长、肺的损伤减轻。4、对H99-EXO、PBS-EXO共孵育的小鼠BMDM及FCNA敲除、野生型小鼠的BMDM进行转录组学分析,发现二者共有的差异表达基因有20个,其中4个相同的差异基因同时上调,通过荧光定量PCR验证后发现C1ql3、Pcdhb3、Shroom1基因在两组巨噬细胞中表达均上调,同两组转录组学结果一致。综合前几部分结果,提示小鼠血浆外泌体中的FCNA蛋白调控巨噬细胞抗新生隐球菌感染的能力可能与巨噬细胞中C1ql3、Pcdhb3、Shroom1基因表达变化有关。四、结论:小鼠血浆外泌体中的FCNA蛋白调控巨噬细胞抗新生隐球菌感染的能力可能与巨噬细胞中C1ql3、Pcdhb3、Shroom1基因表达变化有关。