研究背景:阿尔茨海默病（Alzhermer’s disesase,AD）是引起痴呆最常见的类型,其病理特点主要是过度磷酸化的tau蛋白堆积形成的细胞内神经纤维缠结和淀粉样蛋白β（Amyloidβ,Aβ）组成的细胞外淀粉样斑块沉积。有毒性的Aβ肽是由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）经过β-和γ-分泌酶连续切割产生的。尽管目前针对Aβ开发的药物尚未成功,但淀粉样蛋白级联假说仍被广泛认为是AD发病的主要原因。APP降解和代谢的稳态在AD的发病机制中起到至关重要的作用,这一过程与内溶酶体系统中从多泡体（multivesicular bodies,MVB）到溶酶体的每个细胞器都有关联。在病理条件下,APP可能被内吞到内体-溶酶体系统中,其中APP C端片段β（APP C-terminal fragment β,APP-CTFβ）和Aβ单体分别由β-和γ-分泌酶产生。一方面,APP-CTFβ/Aβ肽被分选到MVB,并最终将含有APP-CTFβ/Aβ的外泌体释放到细胞外。另一方面,内吞的APP和切割的肽也可能被运输到溶酶体进一步降解。因此,复杂的APP加工和运输网络主要依赖于内体-溶酶体-外泌体系统,内体-溶酶体转运平衡受损可能导致Aβ代谢异常,最终引起AD发病。然而,调节溶酶体降解和外泌体分泌平衡的关键分子目前仍然是未知的。WWC1基因首次被描述与人类记忆能力相关,最初的名称是肾脑表达蛋白（kidney and brain expressed protein,KIBRA）,是一种在突触后膜富集的适配器蛋白,可与各种突触后成分（包括肌动蛋白调节网络、非典型蛋白激酶M ζ和突触树突蛋白）相互作用,参与多种细胞功能,如调节突触可塑性、学习记忆功能、细胞凋亡等。此外,目前更多的证据表明,KIBRA蛋白与细胞的极性和囊泡转运有关。WWC1 C2结构域具有脂质结合能力,优先选择3-磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol-3-phosphate,PI3P）结合,而PI3P主要在内体膜上富集,表明KIBRA可能参与调节内溶酶体系统中的囊泡运输。我们之前的研究也表明,KIBRA通过抑制Rab27a的蛋白酶体降解来调节外泌体的分泌。考虑到内体-溶酶体-外泌体运输在Aβ代谢中的重要作用,我们猜测KIBRA可能通过调节外泌体分泌来影响Aβ代谢。研究目的:1.探讨KIBRA能否影响Aβ代谢;2.探讨KIBRA调节Aβ代谢的机制。研究方法和结果:1.构建KIBRA-/-5XFAD双杂交小鼠和APPswe过表达背景下的KIBRA-KD细胞系为了研究KIBRA能否影响Aβ代谢,体内实验我们选用了 5XFAD转基因小鼠,将5XFAD小鼠与KIBRA敲基因小鼠进行杂交,通过基因型鉴定筛选获得KIBRA-/-5XFAD双杂交小鼠。在体外实验中,我们在小鼠海马神经元细胞系（Murine HT22 cells）中过表达人的APPswe基因（包含Swedish突变,K670N和M671L）形成APPswe过表达细胞系。然后通过CRISPR-Cas9慢病毒技术将APPswe过表达细胞中的KIBRA基因敲低,构建APPswe过表达背景下的KIBRA敲低细胞（KIBRA-knockdown,KIBRA-KD）,并通过蛋白免疫印迹技术（western blotting,WB）和实时定量聚合酶链式反应（real-time PCR）验证KIBRA是否敲低以及APP是否过表达。2.检测KIBRA敲除后5XFAD小鼠脑组织中各种形式的Aβ代谢产物为了研究KIBRA对Aβ代谢的作用,我们通过多种抗体和染色方法检测KIBRA敲除后对脑内Aβ的影响。首先,我们通过ELISA技术、斑点印记技术、硫磺素染色、WB等方法检测了全脑组织内的Aβ,包括FA-可溶性和TBS-可溶性的Aβ单体、Aβ寡聚体、淀粉样斑块。另外,为了验证KIBRA是否与APP有直接的作用或者对Aβ的产生有影响,我们进一步通过WB检测了全长的APP和APP-CTFβ。我们的结果发现在AD发病早期阶段,5XFAD小鼠中KIBRA的敲除显著减少了从单体、寡聚体到淀粉样斑块的Aβ代谢物,但不影响APP蛋白水平。其次,我们通过数字切片扫描技术定量分析了 KIBRA敲除对神经元内Aβ的影响。皮层和海马区中的4G8阳性大锥体神经元密度的定量分析显示,相比5XFAD小鼠,3-5月龄的KIBRA-/-5XFAD小鼠脑内4G8阳性神经元密度没有显著变化,表明KIBRA缺失对神经元内APP-CTFs/Aβ的表达没有影响。此外,与过表达APPswe背景下的对照细胞相比,KIBRA-KD细胞中的胞内APP、APP-CTFβ、Aβ40和Aβ42水平也没有显著变化。这些结果提示KIBRA敲低对细胞内APP-CTFs/Aβ没有显著影响,只会降低细胞外的APP-CTFs/Aβ。3.分离及检测KIBRA-KD细胞上清和KIBRA-/-5XFAD小鼠脑组织间隙中的细胞外囊泡及内容物APP-CTFβ/Aβ为了探索KIBRA对Aβ影响的机制,我们进一步检测了 KIBRA是否可能调节含有APP-CTFβ/Aβ 的细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）的分泌。首先,KIBRA-KD 及其对照细胞的细胞培养上清进行梯度离心得到富含EVs的沉淀。所得EVs沉淀用过滤后的PBS重悬进行NTA检测,或用含有PMSF的细胞裂解液重悬,用于WB检测。我们发现KIBRA敲减导致外泌体相关的标志物蛋白（例如,Alix、CD63和CD9）和数量显著减少。为了检测EVs中的Aβ,我们将超离之后得到的沉淀进一步通过蔗糖密度梯度离心进行纯化,以减少可溶性蛋白和蛋白质聚集体污染,获得的EVs在Simoa平台进行检测。结果发现与同等数量的对照细胞相比,KIBRA-KD细胞分泌的EVs中的Aβ40或Aβ42肽和APP-CTFβ水平显著下降,表明KIBRA敲减降低了 EVs相关的APP-CTFβ/Aβ 的分泌。其次,为了进一步在生理条件下探索KIBRA对细胞外囊泡分泌及其内容物的影响,我们通过密度梯度离心的方法分离KIBRA-/-5XFAD小鼠和同窝、同性别KIBRA+/-5XFAD和5XFAD小鼠的脑组织间隙中的EVs,比较EVs中外泌体蛋白标志物及内容物APP-CTFβ/Aβ的表达水平。我们的结果发现与5XFAD小鼠相比,KIBRA-/-5XFAD小鼠脑组织间隙EVs（CD63和CD9）明显减少,并且KIBRA-/-5XFAD小鼠脑组织间隙提取的EVs中的Aβ40、Aβ42和APP-CTFβ水平明显降低。这些结果表明,KIBRA的下调导致含有APP-CTFβ/Aβ的EVs分泌减少。另外,电镜结果分析显示,KIBRA-/-5XFAD小鼠的海马和皮层神经元中MVB和腔内小泡数量明显增加。共聚焦定位分析显示,KIBRA敲除引起小鼠脑神经元中AβPP/Aβ与CD63的共定位显著增加。这些结果表明,KIBRA的缺失可能会通过增加MVB数量来进一步促进Aβ的蓄积。4.检测KIBRA敲除后对溶酶体功能的影响为了研究KIBRA影响Aβ代谢的机制,除了关注外泌体的分泌外,我们进一步检测了 MVB在细胞内的另一条转运途径,即溶酶体的功能。首先,我们通过共聚焦定位分析KIBRA-/-5XFAD和5XFAD小鼠神经元内MVB和溶酶体的融合效率。结果显示,与对照小鼠相比,KIBRA-/-5XFAD小鼠的皮层和海马区MVB的标记物CD63与溶酶体标记物Lamp2的共定位显著增加。其次,通过WB检测发现KIBRA-/-5XFAD小鼠脑组织中溶酶体的膜蛋白Lamp2和组织蛋白酶D（Cat D）的表达水平和成熟度明显增加。最后,我们通过共聚焦定位分析发现在3-5月龄的KIBRA-/-5XFAD小鼠的皮层大锥体神经元中,AβPP/Aβ（抗体4G8染色）和溶酶体标记物Lamp2的共定位显著增加,KIBRA敲除也明显增加了神经元中AβPP/Aβ与Cat D的共定位。这些发现支持了 KIBRA敲除通过间接增加MVB-溶酶体融合进而促进溶酶体降解APP-CTFβ/Aβ的观点。5.检测在KIBRA-KD细胞中抑制溶酶体的功能是否逆转细胞外囊泡的分泌为了进一步验证KIBRA敲除后代偿性地增加溶酶体对APP-CTFβ/Aβ的降解功能,我们在KIBRA-KD和对照组细胞中抑制溶酶体的功能,检测抑制溶酶体的功能之后是否可以逆转KIBRA敲低对细胞外囊泡分泌的影响。首先,我们通过溶酶体抑制剂巴佛洛霉素A（Bafilomycin A1,BafA1）抑制氢离子泵,降低溶酶体的降解功能。我们的结果表明,BafA1抑制溶酶体功能后使EVs分泌增加。其次,为了排除溶酶体抑制剂对MVB与溶酶体融合的非特异性影响,我们使用siRNA技术敲低了 Rab7的表达。Rab7敲低挽救了 KIBRA-KD细胞中EVs的分泌。更重要的是,在用BafA1或siRNA处理后,KIBRA-KD细胞中提取的EVs中的APP-CTFβ水平、Aβ40和Aβ42肽水平明显增加。这些发现表明,KIBRA主要通过控制EVs相关的APP-CTFβ/Aβ的分泌来调节Aβ代谢,而且抑制过量MVB与溶酶体的融合挽救了携带APP-CTFβ/Aβ的EVs分泌。6.检测在人群中KIBRA SNP多态性位点与血浆Aβ的关系为了探索KIBRA基因SNP多态性是否与人血浆中的Aβ水平相关,我们对来自MIND-China研究的子样本（n=1419）中的KIBRA的基因单核苷酸多态性风险位点和外显子区进行了测序。在Simoa平台采用Human Neurology 3-Plex A assay试剂盒检测血浆Aβ40和Aβ42水平。在KIBRA编码区内鉴定的九个错义突变中,rs28421695与血浆Aβ40和Aβ42水平相关。结果显示,与A/A的携带者相比,具有rs28421695的T等位基因（A/T）的携带者的血浆中Aβ40和Aβ42水平降低,而相比A/A携带者,Aβ42/Aβ40比率在A/T携带者中更高。这些结果表明,KIBRASNP rs28421695与人类血浆Aβ水平降低显著相关,KIBRA功能的丧失引起EVs分泌减少可能和Aβ代谢相关。研究结论:1.KIBRA敲除明显降低了 5XFAD小鼠大脑中多种形式的Aβ,包括单体、寡聚体和细胞外淀粉样斑块沉积;2.KIBRA敲除降低了 APP-CTFβ/Aβ相关的EVs分泌;3.KIBRA敲除促进了溶酶体对APP-CTFβ/Aβ的降解,抑制溶酶体的功能挽救了APP-CTFβ/Aβ相关EVs的分泌;4.在人群队列中,KIBRA的全外显子测序显示rs28421695多态性与血浆Aβ水平存在相关性。