免疫应答是免疫细胞相互作用的结果。树突状细胞(dendritic cells,DCs)和天然杀伤(natural killer,NK)细胞是体内两种重要的免疫细胞群体,近年来它们之间的相互作用及其意义备受关注。体内、外的研究均证实,DCs和NK细胞相互作用可导致双方相互维持生存、相互激活,同时,活化的NK细胞能杀伤未成熟DCs(imDCs),甚至可选择性地杀伤淋巴结中部分成熟DCs(mDCs),从而发挥负向调节DCs的功能。自1999年以来,这一相互作用已在一些肿瘤和病毒感染模型中得以证实,在人急性髓样白血病(AML)的“HLA分子半匹配”骨髓干细胞移植治疗中亦发现供者NK细胞可杀伤受者DCs,从而降低GvHD的发病率。由此可见,在抗感染、抗肿瘤、移植和疫苗制备等方面,DC-NK的相互作用均具有重要的应用价值。然而,现已知DCs和NK细胞均为异质性的细胞群体,不同的细胞亚群调节着机体不同的免疫应答。那么,这两者的亚群之间是否亦存在类似的相互作用?其分子机制如何?有何生理病理意义?迄今为止这些均不清楚。 diffDCs是本室最近发现的新型调节性DC亚群,由mDCs在脾脏基质细胞的作用下分化而来,具有高分泌IL-10和NO、抑制抗原特异性CD4~+T细胞增殖的功能,提示浙江大学博士学位论文中文摘要可能在获得性免疫应答晚期起负性调控作用。这一发现推翻了mDCs是终末分化细胞的传统认识,揭示了微环境调节免疫应答的重要机制。本课题是在本室已有工作的基础上,研究了diffl)Cs高分泌IL10的分子机制,以及diffl)Cs与脾脏静息NK细胞的相互作用关系,以期进一步拓展对diffDCs特征和功能的认识。结果发现:diffl)Cs高分泌IL10要依赖于MA卫Ks等通路的活化;dif山Cs能诱导静息的脾脏NK细胞活化,增强其细胞毒功能,该现象在LPS刺激后的diffDCs身上更加明显:;进一步研究发现,IL10和未知的膜分子介导了dif【DCs激活NK细胞的过程;奇怪地是,我们亦发现diffDCs活化的脾脏NK细胞反过来能杀伤新鲜分离的diffDCs,但其确切机制尚待研究。这些实验结果提示,除了抑制抗原特异性CD4+T细胞增殖以外,dif田Cs还能与脾脏NK细胞相互作用,调节机体的固有免疫和获得性免疫应答。 第一部分dim〕Cs对脾脏NK细胞的影响及其机制探讨一、dim〕Cs高分泌IL.10与胞内信号通路的关系 高分泌IL10是diffl)Cs的重要特征之一,LPS刺激后尤为明显。因此,我们首先研究了diffDCs高分泌110的分子机制。我们纯化了maDCs和dif田Cs,一部分细胞用soong/inl的LPS刺激24小时,然后收集细胞进行表型分析,上清用于细胞因子检测;另一部分细胞等浓度的LPS分别刺激不同的时间(0、lf)、20、40、60min),然后收集细胞进行V几stem Blot分析,结果发现:LPS刺激后,dil幻DCs的协10分泌显著增强,但表型基本上未见明显改变;LPs刺激后,MApKs通路的相关蛋白ERK、JNK、p38均有磷酸化,其中ERK磷酸化最为明显,廿S未刺激时亦呈现明显磷酸化;同时,无论LPS刺激与否,NF一虑存在持续核转位现象。阻断ERK、JNK或p38可导致di如Cs分泌IL10的水平显著降低,而阻断NF.虑后却未发现协10分泌有明显改变。据此,我一第4页-浙江大学博士学位论文中文摘要们认为:LPS对diffDCs的表型几乎无影响,但可显著增强IL10分泌,后者与胞内MAPKs(ERK、JNK、P38)信号通路的活化密切相关,而与NF-虑的核转位的关系尚待证实。二、diffl〕Cs能活化脾脏静息的NK细胞为了进一步研究diffDCs的其他功能,我们分析了它与脾脏NK细胞的关系。我们首先分离纯化了diffDCs和脾脏静息的NK细胞,一部分diffDCs用500ng/ml廿s刺激24h,然后按照一定的Dc:NK比例混合,共同孵育2.4h,收集上清检测IFN一Y水平。结果发现IFN一Y水平显著上升,胞内染色证实这种IFN..Y来自于脾脏NK细胞,同时脾脏NK细胞共培养后CD25和CD69表达上调,细胞毒功能明显增强。廿S刺激后的diffDCs也有类似的功能。因此,我们认为,diffDCs能激活脾脏静息的NK细胞分泌IFN.丫,增强其细胞毒功能,在炎症感染等情况下(廿S刺激)这一作用可能尤为明显。三、di们匡)Cs活化脾脏静息NK细胞的机制为了分析diffDCs活化脾脏静息NK细胞的机制,我们首先做了transwell隔离共孵育实验。按照一定的DC:NK比例,将diffDCs或diffOCs一U,S与脾脏静息的NK细胞隔开进行共孵育,24h后收集上清检测IFN一Y水平,结果发现,隔离共孵育后的IFN一Y水平显著低于完全接触共孵育的IFN一丫,但仍高于单纯NK细胞或di皿Cs培养后分泌的IFN一Y水平。这说明,di皿cs活化脾脏静息NK细胞与可溶性因子和细胞的直接接触均密切相关。接下来,我们用一定浓度的抗110、抗IL12、抗NO或抗TGF一B等中和性抗体与diftDcs或dillDCs一LPS预先作用1h,然后加入新鲜分离的脾脏静息NK细胞,共孵育24h后收集上清检测IFN守水平,结果发现:阻断NO或TGF一B后IFN一水平未见显著变化,阻断IL12后稍有下降(但无统计学意义),而阻断IL10后IFN一Y水平明显降低;为了观察IL10和IL12之间是否存在协同作用,我们联合阻断了IL10和IL12,结果一第5页-浙江大学博士学位论文中文摘要发现IFN一Y水平亦明显下降,与单纯阻断110后的结果类似。为了进一步证实IL10的作用,我们利用IL10缺陷的同品系小鼠制备了IL 10一/-dif