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本研究采用本实验室前期研究的以猪股骨酶解的酶解液为原料,分别利用超滤、凝胶层析、离子交换层析、制备型反相高效液相色谱分离纯化技术从酶解液中分离纯化猪股骨降血压肽。采用0.22μm、0.45μm两种孔径滤膜过滤猪股骨酶解液,再利用截留分子量为5kD的超滤离心管对过滤后的酶解液进行超滤,比较两种滤膜过滤的酶解液超滤分离后滤液的色值、澄清度、蛋白得率及ACE(血管紧张素转换酶)抑制活性。研究显示：0.22μm微孔滤膜处理的酶解液超滤后的色值、澄清度效果好于0.45gm微孔滤膜,两者超滤后分子量段的ACE抑制率差异不显著,蛋白得率前者较低。将猪股骨酶解液超滤分离后<5kD的酶解滤液(其IC50值为1.362mg/mL)进行凝胶层析分离,研究了洗脱液、流速、上样量三个因素对猪股骨降血压肽分离纯化效果的影响。结果表明：以去离子水为洗脱液,控制进出流速为0.6mL/min,上样量为1%时,能够得到最佳分离效果,其最高活性组分IC50值达到0.4016mg/mL。猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析初步分离后,为了得到更高活性且纯度更高的降血压肽,采用离子交换层析对凝胶层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱液pH、离子强度、流速三个因素进行研究,确定了最佳分离条件：以pH=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液、B液为含1mol/LNaCl的pH=6.0. 0.05mol/L磷酸盐缓冲液,洗脱流速为0.8mL/min。结果显示：离子交换层析分离得3个组分,其中组分1的活性最高,其IC50值为0.1012mg/mL;离子交换层析之后得到的猪股骨降血压肽溶液含有大量的盐类,再利用凝胶层析将组分1进行脱盐,其峰2的IC50值达到0.0836mg/mL,脱盐率达到86.60%+0.5%。猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析、离子交换层析分离后,为了进一步纯化猪股骨降血压肽,采用制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)对离子交换层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱条件的优化,确定了最佳分离条件：0-5min 0-80%A;5-8min 80-100%A;8-15min 80-60%A;15-20min 60-20%A。结果显示：第一步RP-HPLC分离得到三个组分,其中峰Z2的活性最高,其IC50值为0.0437mg/mL;再将组分Z2进行第二步RP-HPLC分离,其峰Z21(记为组分H)的IC50值达到0.0352ms/ml,经纯度鉴定后,组分H的纯度为96.7%。通过分析组分H的氨基酸组成以及LC-MS的分离鉴定,其含有6种氨基酸(Glu,Ala,Val,Leu,PHe,Pro),其分子量为764.8D。