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细胞衰老和自噬是细胞对应激的两种应答方式，它们之间存在一定的联系。越来越多的证据表明自噬可以调节细胞衰老并且影响细胞的寿命。有研究发现Caffeine在酵母菌和哺乳动物细胞中能诱导自噬，并且Caffeine被报道具有延长酵母菌寿命和缓解细胞衰老的作用。但是目前并不清楚Caffeine缓解细胞衰老的作用是否与其诱导自噬的作用有关。据此，本论文将考察Caffeine缓解细胞衰老的作用与自噬之间的关系，并进一步探讨Caffeine诱导自噬的分子机制。首先，使用自由基诱导剂AAPH作用于A375细胞诱导细胞发生衰老，建立氧化应激诱导的细胞衰老模型，并在此模型的基础上考察Caffeine缓解细胞衰老的效果。采用MTT法和流式细胞术分别检测细胞的增殖抑制率和ROS生成量及线粒体膜电位，实验结果发现AAPH呈时间浓度依赖性抑制A375细胞增殖，抗氧化剂NAC能缓解AAPH对细胞的增殖抑制作用。结果也显示AAPH呈时间浓度依赖性增加细胞内ROS生成并降低线粒体膜电位。通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色、western blotting及激光共聚焦显微技术检测细胞衰老相关的指标，实验结果显示1mM AAPH作用于A375细胞48h时，能显著增加衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比、p53蛋白的磷酸化、p21蛋白表达及衰老相关异染色质位点（SAHFs）阳性细胞的百分比，而NAC则能显著的降低这些细胞衰老指标的表达。以上结果表明，AAPH通过导致氧化应激而诱导细胞衰老。在此模型的基础上，我们接下来考察Caffeine缓解细胞衰老的效果，发现采用Caffeine预处理细胞能显著降低AAPH所致的细胞增殖抑制率、衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比、p53蛋白的磷酸化和p21蛋白表达，表明Caffeine能缓解AAPH诱导的细胞衰老。其次，考察Caffeine缓解细胞衰老是否与诱导自噬有关。通过激光共聚焦显微技术、western blotting、透射电镜等实验手段发现Caffeine可以增加自噬小体的数量、Beclin1的蛋白表达、LC3I向LC3II的转化及自噬溶酶体的数量，说明Caffeine可以提高细胞的自噬水平。激光共聚焦显微技术的结果显示自噬小体和线粒体有良好的共定位，透射电镜的结果也发现自噬溶酶体中存在正在降解的线粒体，提示Caffeine能够诱导线粒体自噬。此外，自噬促进剂rapamycin加强了Caffeine诱导自噬的作用，同时也增强了其缓解细胞衰老的作用；而自噬抑制剂3-MA则减弱了Caffeine诱导自噬的作用，同时也阻断了其缓解细胞衰老的作用，表明诱导自噬有利于缓解细胞衰老自噬参与了Caffeine缓解细胞衰老的过程。最后，考察Caffeine诱导自噬的分子机制。通过western blotting检测相关蛋白表达，发现Caffeine可以提高SIRT3的蛋白表达和AMPK的磷酸化。选择性A2A受体拮抗剂SCH58261也能增加SIRT3的蛋白表达和AMPK活化。同时，SCH58261也提高了Beclin1的表达和LC3I向LC3II的转化减少了p53的磷酸化和p21的表达，并且其效果优于Caffeine。选择性A2A受体激动剂CGS26180则阻断了Caffeine提高SIRT3蛋白表达和AMPK磷酸化的作用，并且还减弱了Caffeine对Beclin1表达、LC3I向LC3II转化、p53的磷酸化和p21表达的影响。激光共聚焦显微技术检测SAHFs发现SCH58261和Caffeine均能显著减少SAHFs阳性细胞百分比，而CGS26180则减弱了Caffeine的作用。以上结果表明Caffeine可能通过拮抗A2A受体而上调SIRT3表达，激活AMPK，诱导自噬进而缓解细胞衰老。用siRNA转染技术干扰SIRT3基因表达后，Caffeine诱导的AMPK磷酸化显著减少，提示SIRT3是AMPK上游的调节因子。此外，Caffeine上调自噬相关蛋白表达和下调p53磷酸化及p21表达的作用也被SIRT3的siRNA转染阻断，说明Caffeine通过上调SIRT3激活AMPK进而诱导自噬缓解细胞衰老。综上所述，AAPH可以导致A375细胞氧化应激，从而诱导细胞衰老。Caffeine能通过诱导自噬，特别是线粒体自噬，而缓解氧化应激导致的细胞衰老。Caffeine诱导自噬的机制可能与A2A受体/SIRT3/AMPK信号通路有关。