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N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物长链非编码RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)和信使 RNA(messenger RNA,mRNA)和中最常见、含量最多的甲基化修饰,参与mRNA的剪接、翻译和降解等多种代谢过程,在基因的表达调控中起重要作用,与配子发生、胚胎发育、细胞凋亡等多种生命活动有关。m6A修饰由甲基转移酶(writer)和去甲基化酶(eraser)共同调控,过程动态可逆。m6A由甲基识别蛋白(reader)识别并发挥生理功能。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,MUM2(Muddled meiosis 2)、IME4(Inducer of meiosis 4)和 SLZ1(Sporulation-specific leucine zipper 1)共同构成甲基转移酶复合物(MIS complex,MIS)。其中,IME4具有甲基转移酶活性,MUM2可能通过活化IME4的催化活性或通过将IME4靶向mRNA从而激活整个MIS复合物;SLZ1可能只具有附属功能。基于酵母系统研究的方便性,研究MIS复合物可以加深对m6A修饰功能的理解,从而加深对其生物功能的研究及相关人类疾病的研究。本研究对MIS复合物蛋白基因MUM2、IME4和SLZ1在大肠杆菌中进行了表达,并通过单因素法对蛋白的表达条件进行优化,同时对表达后的蛋白进行了纯化以满足后续对结构和功能研究的需求。MIS复合物蛋白的基因克隆:以Mammalian Gene Collection(MGC)中的酵母基因文库(SccDNA)为模板,通过生物信息学分析结合文献资料确定目的基因序列,设计引物并通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出不同的目的基因序列,以pET28a-MHL为原核表达载体成功构建了 15个重组质粒。MIS复合物蛋白在大肠杆菌中的表达:测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞并用IPTG诱导蛋白表达。菌液破碎后取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测,结果表明以可溶性形式表达的蛋白有8个,包涵体形式表达的有4个,其余3个不表达。MIS复合物蛋白表达条件的优化:采用单因素试验对蛋白表达培养条件(诱导时间、诱导温度和IPTG浓度)进行了优化,确定了IME41-600、IME41-110、MUM21-366、MUM2180-366、SLZ12-298、SLZ12-129 发酵表达的条件。MIS复合物蛋白的纯化:根据蛋白理化性质的不同,破碎后的粗蛋白液,经过亲和层析、离子交换层析或分子筛层析纯化得到纯度较高且稳定性较好的蛋白(IME41-600、IME41-110、MUM21-366、MUM2180-366、SLZ12-298、SLZ12-129)。其中,IME41-600通过包涵体变复性的方式纯化,其余蛋白上清纯化,均得到了纯度较高、稳定性较好的蛋白。纯化的蛋白经质谱检测正确。