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日本血吸虫病(Schistosoma japonicum)是严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，目前主要在中国、菲律宾和印度尼西亚等国流行。在中国，防治血吸虫病仍然是一个重要的公共卫生问题。至2007年底，尚有7个省、市、自治区的105个县流行血吸虫病，血吸虫感染者仍有将近67万例；此外，历史上无螺区和一些基本消灭血吸虫病的地区，疫情出现反弹，血吸虫病患者及钉螺面积均有回升趋势；因此，我国现阶段血吸虫病防治任务仍然艰巨。我国血吸虫病防治的主要措施包括灭螺(预防传播)和吡喹酮人群化疗(控制发病)。但是灭螺受自然环境的限制措施难以全面实施，而吡喹酮化疗也存在耐药性产生的潜在危险及再感染问题。为此，血吸虫病疫苗的研制和可能使用被认为是控制血吸虫病流行的可持续性措施。尽管血吸虫病疫苗研究已经有80多年的历史，但是目前尚未找到一个真正有价值的疫苗，其原因很多，其中，人们缺乏在分子水平上对血吸虫生物学特性的全面认识，以及缺乏对其免疫逃避机制的全面认识是其中一个重要的原因。
免疫逃避这个概念是Paul Ehrlich在研究非洲锥虫时提出的，他发现非洲锥虫感染宿主后其自身抗原性发生改变。这个概念提出以后，有关寄生虫免疫逃避机制的研究受到科学者的广泛关注，并取得了一定的进展。但从总体上看，这种认识仍然十分有限。研究发现，血吸虫免疫逃避的存在可能使疫苗诱导保护力或宿主保护性应答降低，甚至完全无效。因此，对血吸虫免疫逃避机制的研究有着非常重要的意义，而且是一个需要从根本上解决的问题。研究资料已经证实，血吸虫尾蚴经皮肤侵入终宿主转化为童虫，首先在皮下停留2-3h，在此过程中血吸虫只引起皮肤的轻微炎症反应，而死的血吸虫尾蚴或皮内注射死虫的提取物却可以引起强烈的炎症反应。这一现象提示，活的血吸虫可能分泌了一种能抑制炎症反应的物质。1996年，Ramaswamy K等从曼氏血吸虫的分泌物中找到一种分子量为16.8kDa的蛋白质，并将其命名为Sm16。随后研究发现，Sm16可以在体外抑制抗原介导的淋巴细胞增殖和脾脏及皮肤淋巴结IL-2的产生、抑制人类角质细胞IL-1的表达、抑制内皮细胞表达ICAM-1；当Sm16被注射入真皮内，可降低LPS对中性粒细胞的趋化作用。其后的更多研究都证实Sm16为一种免疫调节分子，可能与血吸虫逃避宿主对其的免疫应答有关。在分析曼氏血吸虫Sm16研究文献的基础上，本实验室从1999年开始对sj16-Sm16同源物蛋白进行了一系列的研究，包括基因的克隆、重组表达及其活性鉴定。结果初步表明：Sj16与Sm16一样具有免疫调节作用，是一种具有潜在开发价值的虫源性免疫调节活性分子，值得进一步的研究。研究目的和意义在已有工作基础上，本课题重点开展日本血吸虫sj16重组蛋白(resj16)的生物学和免疫学特性研究，从而进一步揭示sj16的免疫调节机制，并为寻找有别于现有免疫抑制剂作用机制的、原创性新型免疫抑制剂／药物提供科学依据，为利用虫源型活性物质的特有生物学特性，开发和研制创新性免疫类药物／生物制剂提供新的思路。本研究也将进一步丰富血吸虫免疫逃避研究的信息，并为血吸虫病疫苗研究奠定实验基础。
研究结果
1、sj16的序列结构特征
sj16基因具有完整的开放读码框，含有一段54bp的信号肽序列，其ORF从第30位到第380位共351bp，编码117个氨基酸的蛋白质，理论分子量是13.65KDa，其等电点pI=9.02。sj16氨基酸序列中除含有1个信号肽序列外，还有1个跨膜区域，两者的结构域都存在N端部分，分别为1aa-16aa和5aa-25aa。二级结构分析发现，Si16共拥有2个潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点，2个潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点，1个酪氨酸激酶(TYR)磷酸化位点，1个N-myristoylation位点，1个潜在的酰胺位点，但这两个半胱氨酸(Cys)都不形成二硫键。存在一个潜在的跨膜区域，其N端在膜内。同源性分析表明其与曼氏血吸虫SPO-1(登录号：AF109180)、曼氏血吸虫抗炎蛋白16即Sm16(登录号：AF269252_1)同源性最高，提示其可能与Sm16功能类似。
2、sj16的生物学特性
半定量RT-PCR结果显示，日本血吸虫虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫mRNA中在351bp处均有一明显条带，同时管家基因β-actin在各个阶段中均有表达，证明Sj16基因在日本血吸虫各个生活史阶段中均有明显表达。
成功构建了pGEX-4T-1-sj16重组质粒，并进行了原核表达，15％SDS-PAGE结果显示在分子量约40kDa处，菌体超声裂解上清中有相应的表达条带，表明可溶性表达获得成功，表达产物经亲和层析纯化，获得纯度较高的目的蛋白。目的蛋白经质谱鉴定确定为sj16。
尾蚴虫体免疫荧光检测结果显示，sj16大致分布于尾蚴头腺、钻腺附近部位，而在尾蚴尾部及体部其他部位没有明显分布。
成虫免疫荧光定位发现，sj16主要分布于虫体内部组织和腔道中，在表膜中没有分布。但其具体的组织定位尚有待于进一步研究。
3、reSj16免疫学特性
3.1 reSj16能调节宿主炎症反应不同剂量的reSj16(1，5，10μg／kg)均可以明显减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和毛细血管通透性增加，抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀，明显抑制实验性腹膜炎小鼠腹腔毛细血管通透性增高，且具有一定的剂量依赖关系。
3.2 reSj16对小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的作用分离和培养BMDC，通过光学显微镜和扫描电镜鉴定发现，具有典型的DC形态，通过流式细胞术检测具有典型的DC表面标记形态。通过AffinityPakTMDetoxi-GelTMEndotoxin Removing Gel处理后，reSj161mg／ml内毒素含量小于0.2EU／Kg，符合《美国FDA终产品检测指南》中关于生物制品中内毒素含量的规范标准。流式细胞仪检测结果表明，未成熟的BMDC经LPS1.0μg／ml刺激24h以后，其DC表面标记CD40、CD80、CD86、CD11c和MHCⅡ类分子的表达水平较对照组有明显的提高。而经过reSj16预先处理组的DC与LPS刺激组相比，DC表面标志CD40、CD80、CD86和MHCⅡ各分子的表达均显著减少(P<0.05)，尤其是MHC-Ⅱ分子降低最明显，而对CD11c的影响相对不明显。
混合淋巴实验表明，LPS1.0μg／ml刺激的BMDC诱导异基因T淋巴细胞增殖的能力最强，显著高于对照组，而0.1、0.5、1.0μg／ml reSj16处理组的BMDC诱导异基因T淋巴细胞增殖的能力较LPS对照组显著减低，甚至低于正常对照组。
利用reSj16刺激成熟BMDC表明，0.1、0.5、1.0μg/ml reSj16刺激12h、24h，Si16处理组Annexin V+／PI-细胞、Annexin、V+／PI+细胞相比对照组有一定的降低，且有一定的剂量依赖关系。当reSj16 0.1、0.5、1.0μg/ml刺激48h后，reSj16处理组Annexin V+／PI+细胞的数目均较对照组有所上升，接近对照组或略高于对照组，但是Annexin V+／PI-细胞仍较对照组为低；刺激72h后，各Sj16处理组细胞AnnexinV+／PI-明显增多，接近对照组或略高于对照组，Annexin V+／PI-细胞较对照组明显增多。
研究小结
1、Sj16编码基因ORF全长351bp，编码117个氨基酸。与曼氏血吸虫Sm16的氨基酸序列一致性高达96％，可能具有与Sm16类似的免疫调节功能。该分子在日本血吸虫虫卵、尾蚴、童虫、雌虫、雄虫中均有表达，无阶段特异性。该蛋白为分泌蛋白，组织学定位于尾蚴虫体头腺和钻腺处和成虫内部组织和腔道内。
2、成功构建了pGEX-4T-1-Sj16原核表达载体，细菌培养物经过IPTG诱导表达出重组融合蛋白，利用亲和层析方法获得具有生物学活性的纯化reSj16重组蛋白，并经过SDS-PAGE和质谱的鉴定。
3、不同剂量的reSj16(1，5，10μg／kg)均可以显著减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和毛细血管通透性增加，抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀，抑制实验性腹膜炎小鼠腹腔毛细血管通透性增高和抑制硫胶质所致小鼠腹腔巨噬细胞的渗出，且具有一定的剂量依赖关系。表明reSj16具有一定的免疫调节功能。
4、reSj16体外刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞，相比于LPS阳性对照组，其DC表面标志CD40、CD80、CD86和MHCⅡ各分子的表达均明显减少，而对CD11c的影响相对不是非常明显。reSj16刺激以后，MHC-Ⅱ、共刺激分子和黏附分子等表达的降低必然影响DC功能的发挥，故推测reSj16对DC功能的影响可能是其引起免疫下调的一个可能的机制。而混合淋巴实验表明reSj16刺激的BMDC诱导同种异基因T淋巴细胞增殖的能力明显降低，再次证明reSj16刺激可以明显抑制BMDC的促增殖能力和抗原递呈能力，并且与BMDC表面标志的改变情况一致，故此均提示，reSj16的免疫调节作用可能部分通过影响DC功能来完成。
5、reSj16对成熟DC凋亡影响不大，可能其不通过促进DC凋亡而直接促进其坏死而影响其功能的发挥。而为什么在早期刺激的时候reSj16对DC的凋亡还有一定保护的问题还有待于进一步研究。