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托品烷生物碱(Tropane alkaloids,TAs)是在临床上常用的一类抗胆碱药物,在镇痛、麻醉、抗晕动病、戒毒、帕金森氏病、农药中毒等治疗方面有良好的作用。目前托品烷生物碱主要从天然植物颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stramonium)、山莨菪(Anisodus tanguticus)等植物中提取,市场需求巨大,工业合成的成本较高。颠茄是被中国药典收录,主要提供托品烷生物碱的商业药源植物,天然的颠茄中托品烷类生物碱的含量很低,利用基因代谢工程来提高颠茄中的托品烷生物碱的含量具有很好的研究意义。本研究通过颠茄基因组DNA克隆得到药用植物颠茄下游关键酶基因启动子H6H-p;从C58C1发根农杆菌pRiA4质粒上克隆得到rolC基因。将rolC基因克隆构建至pBI121的GUS编码区获得CaMV35S驱动的表达载体;同样地,以pBI121为表达载体,H6H-p为组织定位启动子与rolC基因进行载体构建,获得H6H-p驱动的rolC基因定位表达载体;进行转化获取得到EHA105-pBI121-CaMV35S-rolC和EHA105-pBI121-H6H-p-rolC工程菌,通过遗传转化获得EHA105-pCaMV35S-rolC和EHA105-pH6H-p-rolC转基因颠茄。分别对EHA105-pCaMV35S-rolC和EHA105-pH6H-p-rolC的4株转基因苗进行表型分析,发现与对照相比,CaMV35S驱动的rolC基因转基因苗地下部分的根生长茂密,地上部分茎段节间缩短、叶片增多、组培时期提前开花;室外生长两个月后,会出现两种与对照组不同的表型,一种表现为叶片皱缩、另一种表现为叶片细长。同时,室外生长条件下依然提前开花,节间缩短,而且顶端优势下降,叶形改变。而H6H-p驱动下的rolC转基因苗与对照相比,未见明显表型差异和变异。这说明,CaMV35S驱动rolC基因表达会导致颠茄地上部分表型产生变异,而H6H-p驱动rolC基因表达,不会造成地上部分产生变异。进一步对转基因苗的生物碱和基因表达量检测,结果显示,EHA105-pCaMV35S-rol C的4株转基因苗中莨菪碱和山莨菪碱的含量均提高,C-7转基因植株检测出的山莨菪碱含量最高(69.831μg/g),是野生型颠茄对照(15.336μg/g)的4.553倍、空载转基因颠茄对照(20.045μg/g)的3.484倍;C-1转基因植株莨菪碱含量最高(149.787μg/g),高出野生型颠茄(39.588μg/g)对照的3.784倍,高出空载转基因颠茄(37.32μg/g)对照的4.014倍;对rolC基因表达量及合成途径基因表达量分析显示,rolC基因在4株转基因根叶中均出现高表达量,并且表达量越高的植株表型差异越明显,而途径基因PMT、TRI、H6H均只在根中检测出表达量,其中与莨菪碱和山莨菪碱合成相关的H6H和TRI基因表达量均高于对照,说明,rolC基因的表达会提高颠茄TAs合成途径基因的表达,从而促进代谢流向莨菪碱和山莨菪碱合成方向转移。同样地,对EHA105-pH6H-p-rolC的4株转基因的生物碱检测显示,莨菪碱和山莨菪碱含量也得到提升,其中H-C-2转基因植株山莨菪碱含量(60.379μg/g)提升最为显著,高出野生型颠茄(8.538μg/g)的7.072倍,空载转基因颠茄(19.066μg/g)对照3.167倍。荧光定量PCR检测表达量结果显示,与对照相比,H6H-p驱动下的4株转基因在根中检测出rolC基因表达量,而叶中未见表达,表明H6H-p实现对rolC基因的定位表达;而4株EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗中只有H6H表达量均高于对照,对生物碱结果检测显示,4株转基因苗山莨菪碱的含量均提升,同催化其合成的关键酶基因H6H表达量一致;而PMT和TRI只有2个株系基因表达量高出对照,相应地,在莨菪碱提升的4株苗中,H-C-1、H-C-2株系的PMT、TRI基因表达量较对照表达量提升。说明H6H-p驱动下的rolC基因表达同样能提升TAs合成途径基因表达量,进而提升莨菪碱和山莨菪碱的含量,只是提升效率较CaMV35S驱动下的rolC基因表达弱些,但不会使植株地上部分产生变异,对植株生长造成影响。本课题研究结果得出,在颠茄中表达rolC基因能有效提升TAs生物碱合成途径基因表达量,进而提高颠茄中的莨菪碱和山莨菪碱的含量,但会对植株表型产生变异影响;而通过H6H-p组织定位表达的rolC基因,在提高生物碱的同时,不影响颠茄植株表型生长。实现对rolC基因的选择控制,为进一步在颠茄的药用领域培育出高产生物碱颠茄株系,并进一步开展颠茄的TAs生物碱基因工程代谢研究提供一种新的方法。