D-氨基酸广泛存在于微生物、植物和动物中,可用于临床、制药、食品和化妆品等行业。建立一种快捷、精确且灵敏的检测方法以便更深入地研究和了解D-氨基酸的重要作用而备受关注。D-氨基酸脱氢酶能立体特异地催化D-氨基酸脱氨生成相应的α-酮酸,因此研究D-氨基酸脱氢酶并利用它来检测D-氨基酸具有良好的应用前景。本论文对奇异变形杆菌Proteus mirabilis JN458中的D-氨基酸脱氢酶进行了克隆表达,并对其表达载体、诱导条件及纯化条件进行优化,同时对其酶学性质进行研究。主要研究结果如下:（1）成功克隆了2个来自P.mirabilis JN458的D-氨基酸脱氢酶基因Pmdad1（1305 bp）和Pmdad2（1128 bp）,与pColdⅡ连接构建重组质粒,并在Escherichia coli BL21（DE3）中表达。通过预测,Pm DAD1分子量为47.72 kDa,PmDAD2分子量为40.83 kDa。通过对酶活的检测,发现只有Pmdad1编码的蛋白具有D-氨基酸脱氢酶的活性。（2）由于pColdⅡ-PmDAD1的表达量和酶活均不高,因此对PmDAD1蛋白的表达载体和诱导条件进行了优化。选择pET28a、pRSFDuet-1、pETDuet-1和pCol ADuet-1作为表达载体,构建了重组质粒pET28a-Pmdad1,pETDuet-1-Pmdad1,p RSFDuet-1-Pmdad1和pColADuet-1-Pmdad1。得到:pETDuet-1-PmDAD1的表达量和酶活最高,与pColdⅡ-PmDAD1相比提高了1倍。当诱导初始菌体浓度OD₆₀₀为0.4,诱导温度为20℃,诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol·L^-1,诱导时间为16 h时,此时酶活最高。（3）利用镍柱和超高速离心对PmDAD1进行蛋白纯化,并对其纯化条件进行优化。得到:由于PmDAD1与细胞膜紧密结合,利用镍柱无法对其进行分离纯化。在超离心过程中添加0.015%曲拉通X-100,5%甘油和5μmol·L^-1 FAD,在此条件下,可以获得较高纯度和产量的酶。PmDAD1纯化后比酶活为3.7 U·mg^-1,提高了5.6倍。（4）对D-氨基酸脱氢酶进行了酶学性质的研究。得到如下结果:最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0。在20-30℃条件下水浴1 h时表现出稳定的活性。PmDAD1对17种D-氨基酸均有不同程度的氧化脱氨反应,展现了广泛的底物范围。对D-丙氨酸、D-天冬酰胺、D-苯丙氨酸三种底物研究其动力学参数。对于D-丙氨酸,PmDAD1展示了最大的催化效率(k_cat/K_m=7.76 L·mmol^-1·s^-1)和最大的亲和力(K_m=2.07 mmol·L^-1)。