病毒感染是引起机体损伤、诱发感染性疾病的重要原因之一。病毒侵入机体后,天然免疫系统通过模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）对病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）进行识别,进而触发抗病毒天然免疫反应,诱导产生干扰素、炎症因子等物质以抵抗病毒入侵。由于病毒无法独立生存,它们在依赖宿主细胞获得能量与物质以完成自身繁殖的同时,也改变着宿主细胞的代谢方式从而获得更好的生存环境。糖代谢是细胞中最为重要的物质代谢途径之一,病毒感染宿主细胞后改变细胞的糖代谢,通过增强糖酵解来获取更多的能量。除提供物质与能量外,糖代谢在抗病毒天然免疫反应中也发挥重要作用。尽管越来越多的研究显示,糖代谢中多种酶与产物均对病毒感染诱发的免疫反应具有调控作用,糖代谢与抗病毒天然免疫反应之间的相互作用与其中的具体机制仍有待明确。Sirt3隶属于沉默信息调节因子（silent mating type information regulation 2 homolog,Sirtuins）家族,具有依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）的去乙酰化酶活性,参与并调控多种生命活动,在细胞的物质能量代谢、细胞的凋亡、细胞内信号转导等过程中具有重要作用。在糖代谢中,Sirt3可作用于多种关键酶,通过改变酶的活性而调控糖代谢,并进一步参与炎症反应及细胞自噬等免疫过程。目前,关于Sirt3在抗病毒免疫反应中的调节作用及其中的机制尚未完全明确。为了探索Sirt3在抗病毒天然免疫反应中的作用,我们首先对Sirt蛋白家族成员进行了功能筛选。在实验中发现:在Sirt3缺陷的细胞中,病毒复制增加、干扰素-β（interferon-β,IFN-β）产生减少,提示Sirt3可能在抗病毒免疫反应中发挥积极作用。此外,实验结果显示Sirt3缺陷使细胞中乳酸和琥珀酸产生显著增加。为进一步明确Sirt3对病毒感染期间细胞糖代谢的影响,我们检测了Sirt3缺陷细胞在病毒感染后的细胞耗氧率（oxygen consumption rates,OCR）和细胞外酸化率（extracellular acidification rates,ECAR）,结果发现:与对照组相比,Sirt3缺陷细胞在病毒感染后糖酵解显著增强而三羧酸（tricarboxylic acid,TCA）循环减弱,说明Sirt3影响了病毒感染时细胞的糖代谢。那么Sirt3究竟是否通过影响细胞糖代谢而参与调控抗病毒天然免疫反应呢?为了明确Sirt3在病毒感染中的作用,我们用水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）,仙台病毒（Sendai virus,Se V）和单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）分别感染了小鼠腹腔巨噬细胞,发现:在不同病毒感染细胞时,Sirt3缺陷均可引起细胞中IFN-β的产生减少,而与此同时细胞中乳酸、琥珀酸浓度显著升高,且乳酸、琥珀酸的产生与细胞中IFN-β的产生具有一定相关性。随后,我们构建了稳定过表达Sirt3的Raw264.7细胞并给予VSV刺激,发现:在病毒感染时,稳定过表达Sirt3的细胞中VSV的m RNA水平显著降低而IFN-β产生明显增加;此外,细胞中乳酸和琥珀酸的产生显著减少。基于以上结果,我们猜测:在病毒感染时,Sirt3通过减少糖酵解、增加TCA循环和IFN-β的产生来促进抗病毒天然免疫反应。为了验证这一假设,我们分别在体内实验与体外实验中对该问题进行了深入研究。在体内实验中,我们利用Sirt3+/-小鼠与Sirt3-/-小鼠设置同窝对照,探究了Sirt3缺陷对小鼠抗病毒天然免疫反应产生的影响。结果发现:在病毒感染后,Sirt3-/-小鼠生存率显著低于Sirt3+/-小鼠;Sirt3-/-小鼠肺、肝、脾等靶器官内病毒复制增加、IFN-β产生减少,肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）等炎症因子产生增多,肺组织中炎症细胞浸润明显。这些结果提示:Sirt3缺陷导致小鼠抗病毒免疫反应减弱。此外,我们还发现Sirt3-/-小鼠血清中的乳酸和琥珀酸浓度显著高于Sirt3+/-小鼠。随后我们提取了Sirt3+/-小鼠与Sirt3-/-小鼠的腹腔巨噬细胞,在体外实验中进行了进一步研究。结果显示:与体内实验结果相一致,在病毒感染时,Sirt3-/-小鼠腹腔巨噬细胞中VSV的m RNA水平显著升高而IFN-β产生减少。随后,我们检测了上述细胞在病毒感染时的OCR值和ECAR值,该结果提示:Sirt3-/-小鼠腹腔巨噬细胞的ECAR值显著增高而OCR值则降低,说明Sirt3缺陷使细胞糖酵解增强而TCA循环减弱。此外,Sirt3-/-小鼠的腹腔巨噬细胞及细胞培养上清液中乳酸和琥珀酸的浓度均显著升高。通过检测抗病毒免疫反应相关信号通路中蛋白的表达情况,发现:Sirt3缺陷后,干扰素调节因子3（interferon-regulatory factor 3,IRF3）与Tank结合激酶1（tank binding kinase 1,TBK1）以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）与核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路中相关蛋白的磷酸化水平显著下降,说明Sirt3缺陷抑制了抗病毒免疫反应相关信号通路的激活。体内实验与体外实验的结果证实了我们的猜想:在病毒感染时,Sirt3对抗病毒天然免疫反应具有正向调控作用,而该作用与Sirt3减少糖酵解、增加TCA循环并抑制乳酸产生有关。那么Sirt3究竟是通过怎样的机制调控糖代谢并进一步影响了抗病毒天然免疫反应呢?通过查阅文献得知,Sirt3与糖代谢中的关键酶——M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）密切相关。为了探究Sirt3与PKM2间的相互作用,我们通过免疫共沉淀实验与Western blot实验检测了细胞中Sirt3与PKM2的结合情况。结果显示:Sirt3与PKM2能够相互结合,且在病毒感染时二者间的结合增强。随后,我们在激光共聚焦实验中发现:Sirt3与PKM2存在明显共定位,且在病毒感染后,二者间的共定位也出现了增强。那么Sirt3与PKM2结合后,会对PKM2产生怎样的影响呢?考虑到Sirt3的去乙酰化酶活性,我们推测Sirt3可能在与PKM2结合后通过使其去乙酰化而改变活性。在接下来的Western blot实验中,研究结果显示:病毒感染时,Sirt3-/-小鼠的腹腔巨噬细胞中PKM2乙酰化水平显著升高。随后,在HEK293细胞中过表达了Sirt3或其催化突变体Sirt3-H248Y,通过Western blot实验检测了二者在病毒感染后细胞中PKM2的乙酰化水平和磷酸化水平,发现Sirt3的去乙酰化作用依赖于自身的酶活性,且Sirt3介导的去乙酰化作用随后又促进了PKM2的磷酸化。随后,我们探索了PKM2的激动剂TEPP-46及DASA-58或拮抗剂Compound 3k对其磷酸化和乙酰化产生的影响。结果发现:PKM2激动剂抑制了PKM2的磷酸化,但是促进了其乙酰化;而PKM2拮抗剂的作用则相反。然而,在过表达Sirt3的细胞中,PKM2的激活剂及抑制剂对其磷酸化产生的影响被Sirt3介导的去乙酰化作用抵消。这些结果表明:在病毒感染时,Sirt3依赖其去乙酰化酶活性使PKM2乙酰化水平降低、磷酸化水平升高,通过影响PKM2的活性抑制糖酵解、促进TCA循环,而这一过程对机体产生有效的抗病毒免疫反应十分重要。那么其中的具体机制究竟是怎样的呢?乳酸是细胞糖酵解的重要产物,可通过作用于线粒体抗病毒信号蛋白（mitogen-activated protein kinase,MAVS）而抑制维甲酸诱导型-1（retinoic acid-inducible-1,RIG-1）样受体（RIG-1-like receptors,RLR）抗病毒信号通路,对抗病毒天然免疫反应具有抑制作用。由于PKM2能够调控乳酸的产生,我们推测PKM2在病毒感染中的作用与其影响糖酵解与TCA循环、并进一步影响乳酸的产生有关。在实验中发现:病毒感染时,若抑制小鼠腹腔巨噬细胞中的PKM2,细胞糖酵解增强而TCA循环减弱,细胞及细胞上清培养液中乳酸浓度显著升高,细胞内病毒复制增加而干扰素产生减少;而激活细胞中的PKM2,则会得到相反的结果。此外我们还发现,在体内实验中,PKM2激活剂可使小鼠肺、脾中病毒复制减少而IFN-β产生增加。以上结果进一步证实:PKM2活性增强可使细胞糖酵解减弱而TCA循环增强、乳酸产生减少,从而促进抗病毒天然免疫反应。最后,我们探索了外源性乳酸在抗病毒反应中的作用。体内实验与体外实验结果均显示:外源性给予乳酸会抑制抗病毒免疫反应,使病毒复制增加而IFN-β产生减少。综上所述,本研究结果表明:病毒感染时,宿主细胞通过代谢重编程而改变自身糖代谢方式,以减少病毒进入并诱导抗病毒天然免疫反应。在该过程中,Sirt3通过介导PKM2去乙酰化使其活性增强,抑制细胞糖酵解、促进TCA循环,并减少细胞中乳酸的产生,从而发挥对抗病毒天然免疫反应的促进作用。这一发现揭露了糖代谢与抗病毒天然免疫反应间的部分相互作用,能够帮助我们更好的理解其中的作用机制,并提示:控制葡萄糖摄入或靶向糖酵解可能成为治疗病毒感染的一个新的研究方向。