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细菌素(Bacteriocins)是一类由原核生物核糖体合成机制产生的具有抑菌或杀菌活性的蛋白质、多肽或蛋白质复合物。由于细菌素具有高效、无毒、耐酸、耐高温、无残留、无抗药性和不影响食品风味等优点,在食品保鲜和微生态制剂等领域的应用前景良好。本实验以2株食源性病原细菌蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus,简称Bc)0938和ATCC 10987为指示菌,利用改良的“琼脂打孔药剂扩散法”(agar-well diffusion method)对产细菌素的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)进行初步筛选。结果表明,在74株Bt野生菌株中,共有20株Bt对这2株Bc具有大小不同的抑菌活性,其中BtBRC-ZYR2的抑菌效果最好,达137.34U。为了研究Bt BRC-ZYR2的抑菌谱,对其以除Bc 0938和Bc ATCC 10987外的51株食源性病原细菌进行筛选,结果表明,BtBRC-ZYR2对其余51株食源性病原细菌不具有抑菌活性。对菌株发酵上清液产细菌素的过程进行动态监测。结果表明,0-8 h Bt BRC-ZYR2处于对数生长期,对Bc 0938没有抑菌活性。当菌株培养至稳定期34 h时,发酵上清液开始对Bc 0938有抑菌活性,且活性一直保持至72 h;期间抑菌活性处于波动状态,呈多峰型,64 h时抑菌活性达到最高水平(431.57 U)。64 h后,抑菌活性下降。对细菌素ZYR2进行饱和硫酸铵沉淀的结果表明,当硫酸铵浓度为70%-100%时,Bt BRC-ZYR2细菌素的抑菌活性较高;Tricine-SDS-PAGE的结果表明,70%-100%硫酸铵沉淀后蛋白/多肽的含量较多,条带也较丰富。用SDS-PAGE凝胶原位活性检测100%的饱和硫酸铵沉淀的细菌素,可知抑菌物质的大小略小于6.5 kDa,符合第Ⅱ类细菌素的大小。对细菌素ZYR2的理化特性进行了测定。测试了饱和硫酸铵沉淀的细菌素对α-淀粉酶、脂肪酶-Ⅶ、脂肪酶-Ⅱ、RNA酶、溶菌酶、过氧化氢酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、α-胰凝乳蛋白酶-Ⅶ和α-胰凝乳蛋白酶-Ⅱ的稳定性,因细菌素活性不受蛋白酶K的影响,可推断该细菌素不含脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键,同时,该细菌素可能不具有蛋白质的性质而属于多肽。细菌素ZYR2的活性受其他酶的影响不明显。饱和硫酸铵沉淀的细菌素能在100℃的条件下保持活性,热稳定性好,pH耐受范围广(pH 3-9)。研究了 Bt BRC-ZYR2细菌素对Bc 0938营养细胞和芽胞的作用方式。加入细菌素ZYR2后,Bc 0938菌株培养液的OD600逐渐下降,8-12 h从1.76降至0.52,而对照组的OD600值呈J型增长,推测细菌素ZYR2可能对Bc 0938营养细胞存在溶菌作用;同时,菌液8-12h的活菌数由1010CFU/mL降至106CFU/mL,而对照组的活菌数为1010CFU/mL,表明细菌素ZYR2主要通过杀菌的方式对Bc0938营养细胞起作用。此外,24 h内Bc 0938芽孢悬液的OD600维持在0.01左右,而对照组的OD600呈J型增长,8-24 h处于1.8-2.0之间,可知细菌素ZYR2可有效抑制芽胞萌发。通过凝胶过滤层析、DEAE-52离子交换层析和HHPLC反相C18层析对细菌素ZYR2进行分离纯化后,得到的活性组分的蛋白含量为25.6 μg/mL,活力为140.12 U,总回收率为23.0%。通过MALDI-TOF MS测定其分子量为4.29kDa,采用在线ProteinPilot软件检索未发现与其匹配的蛋白质。