目的:明确衰老髓核细胞内p16基因表达是否增加;明确上调髓核细胞内p16基因表达,是否可以加速其衰老;明确下调髓核细胞内p16基因表达,是否可以延缓其衰老;明确p16基因敲除是否可以延缓小鼠椎间盘退变;明确p16基因敲除延缓小鼠椎间盘退变是否与其抑制氧化应激及抑制细胞衰老相关;明确p16基因敲除是否通过p16-CDK4/6-p Rb-E2F信号通路调节细胞周期延缓小鼠椎间盘退变。方法:构建p16基因过表达质粒和小干扰si RNA,分别转染于原代人髓核细胞内,构建p16基因过表达和低表达人髓核细胞。利用细胞因子IL-1β刺激人髓核细胞,构建髓核细胞退变模型。分别设计正常人髓核细胞组（control组）,IL-1β刺激髓核细胞退变组（IL-1β组）,IL-1β刺激+p16基因过表达（IL-1β+p16组）,IL-1β刺激+p16基因si RNA沉默组（IL-1β+si RNA组）。细胞贴壁后加药培养24至72小时后收集细胞,利用分子生物学及组织病理学方法比较上述4组细胞相关指标差异。利用免疫荧光、RT-PCR和Western blot等方法检测4组细胞p16基因表达差异。利用β-半乳糖苷酶染色比较4组细胞衰老水平变化。利用流式细胞学方法比较4组细胞在细胞周期、凋亡、氧化应激等水平差异。利用细胞CCK8活性实验比较4组细胞增殖水平差异。利用12周龄同窝生野生型（WT）和p16基因敲除(p16-/-)小鼠进行尾部悬吊（Tail suspension,TS）,构建小鼠椎间盘退变悬尾模型,悬吊4周后与正常饲养同周龄小鼠（control组）一起取出脊柱椎间盘标本,利用影像学、分子生物学及组织病理学方法,检验造模效果及椎间盘组织相关表型差异。利用X线、MRI、HE染色、番红O染色等验证椎间盘退变造模成功。利用流式细胞学、ELISA、免疫组化、RT-PCR和Western blot等方法比较4组小鼠椎间盘在细胞周期、增殖、衰老、氧化应激、炎症及p16-CDK4/6-p Rb-E2F信号通路相关基因表达水平的差异。结果:与control组对比,IL-1β刺激后髓核细胞p16基因表达水平上调,衰老程度增加,停滞于G1期的细胞比例增加,细胞增殖水平下降,凋亡细胞比例增加。同样IL-1β+p16组p16基因表达水平更高,细胞衰老程度更严重,增殖水平更低,凋亡比例更大。但IL-1β+si RNA组p16基因表达水平较IL-1β组降低,衰老程度减轻,增殖水平增加,凋亡比例减少。4组细胞氧化应激水平无明显差异。与WT小鼠相比p16-/-小鼠椎间盘退变程度轻,衰老相关指标β-gal、P53、P19,炎症指标IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP等基因表达水平明显降低,氧化应激水平（ROS）降低,抗氧化应激相关指标SOD、GPX、CAT等基因表达水平上调,DNA损伤标志物8-OH-d G降低,细胞增殖相关指标Ki67、PCNA等基因表达水平上调,细胞周期相关蛋白CDK4/6、p RB、E2F1/E2F2表达上调,RB表达水平下降。结论:本研究成果证明髓核细胞衰老程度与p16基因表达水平正相关;上调p16基因表达可促进髓核细胞衰老;下调p16基因表达可延缓髓核细胞衰老。p16基因通过p16-CDK4/6-p RB-E2F信号通路调节髓核细胞周期。p16基因敲除后,可通过抑制髓核细胞内氧化应激水平、抑制炎症、减轻DNA损伤、促进增殖、抑制衰老来减缓椎间盘退变。我们相信本课题的研究成果将为研发有效及安全的治疗椎间盘退变疾病提供理论与实验基础。