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目的:新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗(ATV-NDV)在肿瘤治疗中有着较好的应用前景。白介素-7(IL-7)在淋巴细胞的发育和稳态的维持方面发挥着重要的作用。为了进一步提高ATV-NDV的抗肿瘤效果,我们利用反向遗传学技术将小鼠IL-7基因插入NDV非溶瘤株LX基因组中,构建了表达IL-7的重组新城疫病毒NDV-LX/(IL-7)。我们使用构建的重组NDV-LX/(IL-7)制备ATV-NDV-LX/(IL-7)确定与传统的ATV-NDV相比,ATV-NDV-LX/(IL-7)是否具有更好的抗肿瘤效果。方法:(1)利用反向遗传技术,构建表达红色荧光蛋白(RFP)的重组新城疫病毒NDV-LX/RFP以及表达小鼠白介素-7(IL-7)的重组新城疫病毒NDV-LX/(IL-7)。(2)体外检测两组重组新城疫病毒NDV-LX/RFP和NDV-LX/(IL-7)的生物学活性。用两株重组病毒制备ATV-NDV,体外检测其对小鼠淋巴细胞的激活以及对肿瘤细胞的特异性杀伤。(3)在肿瘤预防模型中,给小鼠皮下分别接种PBS,B16-F10自体肿瘤疫苗,表达RFP的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/RFP以及表达IL-7的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/(IL-7),共接种两次,两次接种间隔14天,第二次疫苗接种后14天,小鼠皮下接种B16-F10肿瘤细胞,观察肿瘤生长情况,检测ATV-NDV-LX/(IL-7)的抗肿瘤效果,并通过流式染色以及细胞杀伤探究其抗肿瘤机制。(4)在肿瘤治疗模型中,给小鼠皮下接种B16-F10肿瘤细胞,构建小鼠黑色素瘤模型,7天后在小鼠对侧皮下分别接种PBS,B16-F10自体肿瘤疫苗,表达RFP的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/RFP以及表达IL-7的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/(IL-7),每周两次,共接种两周,观察肿瘤生长情况,检测ATV-NDV-LX/(IL-7)的抗肿瘤效果,并通过流式染色以及细胞杀伤探究其抗肿瘤机制。(5)在肿瘤治疗实验中,处死小鼠3天前,给每只小鼠腹腔注射100ug EdU,3天后检测脾脏和肿瘤浸润淋巴细胞中EdU阳性的CD8+T细胞的比例,确定CD8+T细胞的增殖情况。(6)在肿瘤治疗实验中,在肿瘤接种后第二天,小鼠腹腔注射CD8中和抗体,清除小鼠体内CD8+T细胞,检测ATV-NDV-LX/(IL-7)对肿瘤治疗效果是否消失,以证明ATV-NDV-LX/(IL-7)对肿瘤的治疗效果是通过CD8+T细胞所介导的。结果:(1)成功构建了表达RFP以及IL-7的两株重组新城疫病毒NDV-LX/RFP以及NDV-LX/(IL-7),感染细胞实验显示NDV-LX/RFP、 NDV-LX/(IL-7)重组新城疫病毒为非溶瘤性病毒,ELISA测感染细胞上清,实验结果显示感染了NDV-LX/(IL-7)的肿瘤细胞上清中可以检测到高水平的IL-7的表达。(2)使用ATV-NDV-LX/(IL-7)体外刺激脾细胞,将刺激后的脾细胞对靶细胞进行杀伤实验,结果显示ATV-NDV-LX/(IL-7)可以显著提高小鼠脾细胞体外杀伤肿瘤的能力。(3)肿瘤预防组实验,结果显示使用ATV-NDV-LX/(IL-7)预先免疫小鼠,可以显著抑制肿瘤生长,流式染色以及计数结果显示,ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠脾细胞中表达IFN-γ的CD8+T细胞比例以及总数显著高于对照组,并且ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠脾细胞对肿瘤细胞的杀伤能力也显著高于对照组。(4)肿瘤治疗实验,使用ATV-NDV-LX/(IL-7)治疗荷瘤小鼠,结果显示ATV-NDV-LX/(IL-7)对肿瘤有着显著的治疗效果,流式染色以及计数结果显示,ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠脾细胞中表达IFN-γ的CD8+T细胞比例以及总数显著高于对照组,肿瘤浸润淋巴细胞增多,肿瘤浸润淋巴细胞中表达IFN-γ的CD8+T细胞和CD4+T细胞比例以及总数显著高于对照组。(5)EdU检测细胞增殖实验中,发现ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠与ATV-NDV-LX/RFP组小鼠相比,CD8+T细胞没有明显的扩增。(6)CD8+T细胞清除实验中,在清除了CD8+T细胞后,ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠的抗肿瘤作用消失,肿瘤大小与对照组相比没有明显差异。结论:使用表达IL-7的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗,与传统的自体肿瘤疫苗以及新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗相比,在肿瘤的预防以及治疗上有着更为显著的抗肿瘤作用,并且这一抗肿瘤作用是由CD8+T细胞所介导的。