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副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性人兽共患病原菌,广泛存在于海洋环境,能够引起人急性肠胃炎、伤口感染和败血症,对动物主要引起水生动物疾病,如海鲷、对虾、九孔鲍、文蛤等。耐热直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin, TDH)、耐热直接溶血相关毒素(TDH-related hemolysin, TRH)、Ⅲ型分泌系统1(T3SS1)和Ⅲ型分泌系统2(T3SS2)被认为是副溶血弧菌的主要致病因子。对实验室近年来保存的33株临床分离株和511株环境分离株进行tdh, trh, vcrD1(T3SS1结构蛋白基因)和vcrD2(T3SS2结构蛋白基因)的PCR检测发现它们在临床分离株中的阳性率分别为100%、9.1%、100%和87.9%,在环境分离株中的分离率分别为11.2%、19.4%、100%和1.2%。T3SS1存在于所有副溶血弧菌分离株中,这与报道相一致。tdh和T3SS2在临床分离株中的阳性率均高于环境分离株,符合致病因子的一般特征。Ⅵ型分泌系统(T6SS)是近年来新发现的一种分泌系统,广泛存在于革兰氏阴性菌变形菌门细菌中,能够增强细菌对外界环境的适应性,介导细菌对宿主细胞的致病力。对副溶血弧菌全基因组序列RIMD2210633分析发现,副溶血弧菌中存在两套T6SS,分别位于染色体1(T6SS1)和染色体2(T6SS2)上。T6SS1基因簇结构与霍乱弧菌的T6SS同源性较高,其结构蛋白基因icmF1在副溶血弧菌临床分离株和环境分离株中的携带率分别为90.9%和25.0%,提示T6SS1可能与副溶血弧菌的致病力密切相关;T6SS2与一些海洋细菌的T6SS具有较高的同源性,其结构蛋白基因icmF2在副溶血弧菌临床分离株和环境分离株中均为100%。为了验证T6SS1和T6SS2是否具有转位和分泌蛋白的功能,本研究选取副溶血弧菌临床分离株HZ为亲本菌株,构建了结构蛋白基因icmF1和icmF2,转位蛋白基因hcpl和hcp2的缺失突变株和回复突变株,并用Hcp1和Hcp2多克隆抗体检测亲本株和T6SS相关基因缺失株中Hcp1和Hcp2的表达和转位情况。缺失icmF2后,Hcp2只能在菌体沉淀中被检测到,而在培养上清中未能检出,说明T6SS2在体外培养条件下是一个功能性的分泌系统,介导蛋白转位和分泌。而Hcp1在亲本株、△icmF1和△Ahcp1的菌体沉淀和培养上清中均检测不到；互补表达的Hcp1能在菌体沉淀中被检测到,但也不存在于培养上清中；荧光定量PCR检测亲本株中icmF1、icmF2、hcp1和hcp2的基因转录水平发现,icmF1和hcpl的转录量仅为icmF2和hcp2的十七分之一和十分之一。说明T6SS1在体外是一个非活化的分泌系统,相关基因处于低表达和低转录状态。为了研究T6SS的生物学功能,本研究首先构建了缺失副溶血弧菌主要致病因子TDH,T3SS1和T3SS2相关基因的三缺失突变株DTTT,并以DTTT菌株为亲本,进一步缺失icmF1、icmF2、hcp1或hcp2基因,从细菌对宿主细胞的感染生物学(细胞粘附、细胞毒性、细胞自噬、细胞凋亡和红细胞溶血能力)和细菌对环境的适应性(生长特性,抗酸应激和形成生物被膜能力)两大方面展开副溶血弧菌两套T6SS的生物学活性研究。副溶血弧菌T6SS1和T6SS2均具有细胞粘附能力。缺失了T6SS1结构蛋白就因icmF1和转位蛋白基因hcp1的细菌,对Caco-2和HeLa细胞的粘附能力显著降低,而缺失了T6SS2结构蛋白基因icmF2和转位蛋白基因hcp2的细菌只对HeLa细胞粘附能力降低。T6SS1在体外培养条件下处于低表达和低转录状态,但在细胞粘附试验中呈现一定的活性,且该活性能被Hcpl抗体阻断。副溶血弧菌T6SS2具有促细胞自噬的能力。△icmF2、△hcp2和△vgrG2缺失株与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养4h后,细胞中LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ的量要显著低于亲本株DTTT,而△icmF1菌株与亲本株相比差异不显著。说明T6SS2可能促进RAW264.7发生自噬。副溶血弧菌感染稳定表达LC3-GFP的RAW264.7细胞,△icmF2缺失株感染的细胞中LC3-GFP的荧光斑点要显著低于亲本株DTTT,进一步证明了T6SS2促进RAW264.7自噬。T6SS2促进RAW264.7自噬的活性可能是通过其转位蛋白和分泌蛋白来实现的。目前T6SS2还未有分泌蛋白发现,因此我们怀疑T6SS2可能通过转位蛋白Hcp2和VgrG2介导细菌的自噬。在RAW264.7中真核表达GFP-Hcp2和口GFP-VgrG2蛋白,发现表达GFP-VgrG2的细胞LC3-Ⅱ的量要显著高于对照组(表达GFP),而表达GFP-Hcp2的细胞与对照组相比无显著差异。向培养RAW264.7的培养基中添加原核表达的Hcp2和VgrG2蛋白,也呈现类似结果：添加VgrG2蛋白后,细胞LC3-Ⅱ的量要高于对照组,添加Hcp2蛋白则变化不显著。说明T6SS2对RAW264.7细胞的自噬作用是通过其转位蛋白VgrG2来实现的。不论是细胞内源性的VgrG2,还是外源添加的VgrG2均能引起细胞自噬,推测VgrG2引起细胞自噬可能在其刺穿宿主细胞膜并进入宿主细胞的过程中,引起自噬途径相关信号的改变。无论是T6SS1还是T6SS2,都不具有细胞毒性和溶血活性,不诱导宿主细胞凋亡。T6SS1和T6SS2也不贡献副溶血弧菌对抗酸应激和形成生物被膜的能力。在T6SS2基因簇的下游,存在两个二元调控因子VPA1045和VPA1049,具有反应调节因子典型的Che-Y结构域。Vpa1045和Vpa1049基因缺失后,hcp2转录水平与亲本相比均差异不显著。免疫印迹分析发现在细菌培养上清中的Hcp2转位量显著下降,而菌体沉淀中Hcp2表达量与亲本相比均差异不显著。进一步的细胞试验发现,Vpa1045和Vpa1049的缺失也降低细菌对HeLa细胞的粘附能力。