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布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病，其病原布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌，感染后，主要引起动物流产和人的波状热。布鲁氏菌无经典的毒力因子，如质粒，外毒素，溶细胞素，荚膜或内毒素特性的脂多糖分子，其毒力主要体现在入侵宿主细胞并在胞内存活的能力，基于此，布鲁氏菌能感染宿主建立慢性感染，较难被清除，因此研究布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活所需的基因对于阐明布鲁氏菌的致病机制具有重要意义。本研究主要采用信号标签转座子随机突变技术和基因芯片技术分别筛选鉴定布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活所需基因，为研究布鲁氏菌致病机制提供理论研究资料。本研究中，我们通过逐步施压的方法，诱导流产布鲁氏菌S2308产生萘啶酸抗性（Nal）作为筛选标记，以抗性菌株为亲本，构建含8个信号标签的转座子随机突变库，共含有突变株3759株，以BABL/c小鼠为动物模型，共筛选2048株突变株，获得89株减毒株。通过步移PCR鉴定了24株减毒株的插入失活基因，其中获得一株粗糙型布鲁氏菌，鉴定为rfbE基因失活，rfbE基因为布鲁氏菌O-抗原转运系统ATP结合蛋白，为进一步研究该基因的功能，我们通过定向缺失技术构建流产布鲁氏菌rfbE基因缺失株，命名为rfbE，经结晶紫染色和热凝集试验确定rfbE为粗糙表型，生长曲线测定发现rfbE在平台期以后生长略慢于野生株，细胞感染试验发现rfbE缺失株提高了入侵巨噬细胞的能力，但明显减弱其胞内存活的能力，通过形态学分析和荧光染色发现rfbE诱导细胞肿胀坏死。通过对BABL/c小鼠模型致病性分析发现rfbE缺失株明显出现减毒现象，不能在小鼠模型上建立慢性感染。此研究表明，rfbE基因参与LPS合成，是布鲁氏菌毒力所必需的。为深入研究rfbE缺失株的特性，我们通过基因芯片筛选rfbE缺失株差异转录基因，发现asp24基因在rfbE中出现明显的上调转录，随后，通过荧光定量PCR和免疫印迹试验表明Asp24上调表达不是粗糙型布鲁氏菌共有的特征，而是与O-抗原ABC转运子缺失引起O-抗原胞内聚集相关，发现一种新的Asp24上调机制。荧光染色试验表明Asp24不是粗糙型布鲁氏菌致死巨噬细胞的原因，酸诱导性试验表明Asp24确实能在酸性条件下被诱导表达，然而Asp24并不是布鲁氏菌抵抗酸性环境所必需的组分。进一步研究发现，Asp24蛋白在胞内环境下被精确调控表达对于布鲁氏菌胞内存活来说是必不可少的。布鲁氏菌能在宿主体内建立慢性感染与其胞内存活的特性是分不开的，因此鉴定布鲁氏菌胞内存活所需基因对于理解其胞内存活机制非常重要，后续试验中我们通过基因芯片技术筛选鉴定了布鲁氏菌在巨噬细胞内存活状态下差异转录基因，发现7.82%的基因上调转录，5.4%的基因下调转录，荧光定量PCR验证芯片差异大于5倍的基因，共发现14明显差异转录基因，分别为：AraC转录调控子（AraC），DnaA结构域蛋白（Ddp），雌烯醇转录调控子（EryD），碱性磷酸酶（Alp），鞭毛基因棒状蛋白（FlgF），四型分泌系统VirB9组分（VirB9），原儿茶酸2,3双加氧酶（Hpcd），醛脱氢酶家族蛋白（ALDH），主要推动家族转运子（MFS），镍离子转运透化酶和四个假定蛋白基因（BruAb11814，BruAb10475，BruAb11926，BruAb10292），分别参与执行各种不同的功能，本研究表明，布鲁氏菌通过调控多种基因的表达来适应胞内存活的条件，是一个复杂的调控过程。流产布鲁氏菌胞内诱导ddp基因，编码一个DNA结合域蛋白，该基因缺失株表现粗糙型布鲁氏菌的特征，但不能被结晶紫染色，免疫印迹试验分析发现， ddp缺失株仅能合成部分O抗原。粘附入侵试验发现ddp缺失株明显提高了入侵巨噬细胞和上皮样细胞的能力，约为S2308株的10-20倍，另外， ddp缺失株与粗糙型布鲁氏菌相似也能诱导巨噬细胞死亡，减弱在巨噬细胞内的复制能力，与S2308相比，明显激活巨噬细胞辅助抗原递呈分子CD40、CD80、CD86和细胞因子IL-6，IL-10和TNF-α的转录。动物试验显示， ddp缺失株不能在小鼠体内建立慢性感染，减弱对小鼠的致病力。本研究表明ddp基因是布鲁氏菌重要的致病基因，是布鲁氏菌毒力所必需的。总之，本论文通过信号标签随机突变技术和基因芯片技术筛选鉴定了布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活时所需要的基因，研究了布鲁氏菌rfbE基因的功能，发现了一种新的Asp24上调机制，探讨布鲁氏菌胞内存活的诱导基因，研究了胞内诱导ddp基因的功能，为布鲁氏菌致病机制研究提供了理论研究资料。