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单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenesis,LM)是一种在环境中普遍存在的革兰氏阳性菌,能引起人和动物严重的食源性感染,致病率高达30%-40%。自溶素是在细菌中普遍存在的肽聚糖水解酶,与细菌的多种生物学功能有关,参与细菌的致病过程。目前,已经从单核细胞增生性李斯特菌中鉴定出8种自溶素蛋白。单核细胞增生性李斯特菌标准菌株EGD-e(1/2a血清型)全基因组序列分析及转录组测序等技术研究表明lmo1521基因含假定酰胺酶结构域及GW模块,在侵染小鼠时该基因表达量上调,预测其可能是自溶素基因。本研究用实验证据鉴定该基因是自溶素基因。本实验以单核细胞增生性李斯特菌lmo1521基因CDS区域为目标基因序列,构建pET-22b-lmo1521重组质粒,转化至蛋白表达宿主菌E.coliBL21(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,原核表达得到可溶性Lmo1521重组蛋白,用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白,从而得到高纯度、高浓度目标蛋白Lmo1 521。综合采用多种方法研究Lmo1521蛋白是否具有细胞壁水解酶活性。首先以提纯的单增李斯特菌细胞壁为底物,采用复性SDS-PAGE电泳,观察纯化的Lmo1521蛋白对单增李斯特菌细胞壁的破坏作用,并进一步用MALDI-TOF-MS质谱技术补充分析实验数据;利用革兰氏染色法观察提纯的Lmo1521蛋白对单增李斯特菌活细胞的破坏作用,根据单增李斯特菌细胞密度及细胞形态的变化规律分析Lmo1521蛋白的活性功能。这些实验结果表明Lmo1521蛋白不仅能够水解提纯的自身细菌细胞壁,还可以有效抑制单增李斯特菌活细胞的生长繁殖,具有细胞壁水解酶活性,水解单增李斯特菌细胞壁的最适pH范围为中碱性。从而首次用实验证据从单增李斯特菌(CMC54002,血清型1/2a)中鉴定lmo1521基因具有自溶素功能。体外原核表达的Lmo1521蛋白具有很好的杀菌及抑菌效果,因此进一步实验可大量表达获得重组蛋白,验证其对更广谱性的细菌的杀菌、抑菌效果,可将其用于新型抗菌剂的研发以及单增李斯特菌病或其它疾病的防治研究。为了进一步解析lmo1521基因的功能,拟构建pMAD△lmo1521重组质粒。利用SOE-PCR分别扩增目标基因lmo1521的上下游基因lmo1520及lmo1522,克隆至穿梭载体pMAD,构建pMAD△lmo1521重组质粒,同时在上下游基因中间加入卡那霉素抗性基因kanamycin,便于重组质粒及后续△lmo1521缺失突变株的筛选。后续实验将pMAD△lmo1521重组质粒电转入野生型单增李斯特菌,根据基因敲除原理筛选△lmo1521缺失突变株,深入研究lmol521基因的生物学功能,pMAD△lmo1521重组质粒的成功构建为后续研究奠定实验基础。