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FHL2(Four and a half LIM domains protein 2)是FHL蛋白家族成员之一,可作为转录因子共结合因子,参与细胞增殖、迁移、凋亡、信号转导和基因转录等诸多过程。目前,基于FHL2的研究主要集中在心脏、骨骼和癌症中,对生殖发育方面的研究较少。研究表明,FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,可通过结合NR5A1,调控抑制素α基因的转录,提示FHL2对生殖具有重要调控作用,但调控作用及作用机制尚不清楚。因此,本实验以昆明小鼠卵巢颗粒细胞(mGCs)为模型,研究FHL2对小鼠颗粒细胞的调控作用及作用机制,旨在为阐明哺乳动物卵泡发育调控机制提供理论基础。主要研究结果如下:(1)FHL2在小鼠卵巢中的时空表达与定位规律:收集新生小鼠(1-6天)及3周和10周的小鼠卵巢,免疫组化实验结果表明,FHL2的表达量随着卵泡组装和原始卵泡池的形成逐渐升高,在颗粒细胞和卵母细胞中均有表达;Western Blot检测结果显示,出生后1天、4天和7天小鼠卵巢FHL2表达量逐渐上升;(2)FHL2在颗粒细胞细胞核和细胞质中表达:Western Blot和免疫荧光方法证明,FHL2在mGCs细胞核和细胞质中均有表达,定位与细胞所处的分裂周期有关;(3)FHL2促进小鼠颗粒细胞的增殖:体外培养小鼠颗粒细胞,分别转染FHL2小干扰RNA或过表达质粒,CCK-8、细胞计数,流式细胞分析方法结果表明,敲低FHL2后,细胞活力显著降低(p<0.01),S期细胞比例显著降低(p<0.05),细胞凋亡显著增加;过表达FHL2,则可以显著促进小鼠颗粒细胞生长(p<0.05),提高细胞活力(p<0.01),抑制细胞凋亡(p<0.05);(4)FHL2通过结合转录因子AP-1和NF-κB调控EGF和EGFR转录:转染FHL2 siRNA后,敲低组EGF和EGFR的mRNA表达量和蛋白表达量显著降低,而超表达FHL2则显著提高EGF和EGFR的表达量;进一步利用Co-IP和CHIP方法证明,FHL2分别结合转录因子AP-1和NF-κB,在转录水平上调控EGF和EGFR的表达;(5)EGF对小鼠颗粒细胞生长的调控依赖于FHL2表达量:EGF(20 ng/mL)可显著促进mGCs增殖(p<0.01)、提高细胞活力(p<0.01),提高S期细胞比例(p<0.001);敲低FHL2后,EGF对颗粒细胞的促增殖作用受到抑制,提示EGF对小鼠颗粒细胞的调控依赖于FHL2表达量;此外,EGF处理可诱导颗粒细胞EGF和EGFR的表达量显著上升;敲低FHL2后再用EGF处理,EGF对其自身和其受体的诱导作用被显著抑制;(6)EGF可促进FHL2表达,尤其是诱导细胞核内FHL2表达量上调:上述实验说明,EGF通路可能与FHL2存在互作,为进一步验证该假设,我们利用EGF处理小鼠卵巢颗粒细胞,结果表明,EGF(20 ng/mL)处理可诱导mGCs FHL2表达;而分别添加EGFR抑制剂(AG1478)、MEK抑制剂(UO126)和PI3K抑制剂(LY294002)则可以阻断EGF对FHL2表达的调控,说明EGF可通过结合EGFR,激活MEK和PI3K信号通路,参与小鼠颗粒细胞FHL2的表达调控;免疫荧光检测结果显示,EGF可诱导颗粒细胞核内FHL2表达量显著上调;Western Blot结果进一步表明,随EGF处理时间的增加,FHL2在核内表达的表达量逐渐增加,呈时间依赖模式。在本研究中,我们发现FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,并参与颗粒细胞的生长调控。EGF与EGFR在细胞膜上结合,激活MEK和PI3K信号通路,调控FHL2表达,并促进FHL2在细胞核内聚集,而核内FHL2可作为转录因子共激活子,通过结合转录因子AP-1和NF-κB,促进EGF和EGFR的表达,从而形成EGF/EGFR/FHL2自分泌通路,调控颗粒细胞的生长与增殖。研究结果阐明了FHL2对颗粒细胞生长的调控作用及作用机制,有助于我们更好的理解哺乳动物生殖发育调控网络,并为提高家畜繁殖力新技术研发提供科学依据。