目的:心肌肥厚是以显著的心室肥厚及舒张功能异常为特点的先天性或获得性疾病,不伴有后负荷的增加（例如主动脉瓣狭窄、主动脉缩窄和全身性高血压）。症状包括胸痛、呼吸困难、晕厥以及猝死。患者在做Valsalva动作时,收缩期杂音明显增强,这是肥厚性梗阻性心肌病的典型表现。心肌肥厚是许多心血管疾病病理变化的后期阶段,慢性肥厚性重构会导致多种心脏功能障碍,这将导致心力衰竭,严重的最终会导致死亡。到目前为止,心肌肥厚的发病机制仍不清楚。瞬时受体电位通道（Transient Receptor Potential,TRP）通道位于各种类型细胞的细胞膜上,是一组非选择性阳离子通道。TRP通道最初在果蝇光感感受器中发现,其携带果蝇光感细胞的突变基因,因该突变基因可引发对光的瞬时响应而得名。基于其同源序列分类,TRP通道可被分为六个亚族,即TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPL和TRPP5。研究表明,TRPM亚家族,特别是TRPM7在心脏疾病中参与着重要生理过程,例如介导钙离子的信号传导,介导镁离子的转运,负性调节Ang II,差异调节血管功能等。研究显示,TRPM7在高血压、缺血性心肌病、心律失常等心脏疾病中均有重要作用,但TRPM7在心肌肥厚领域的报道甚少。香芹酚是一种精油成分,可作为瞬态受体电位Melastatin亚家族7（TRPM7）的非特异性抑制剂,是许多芳香植物的主要产品,包括牛至,百里香等,其对大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）损伤具有保护作用。尚未充分证明香芹酚在心肌细胞凋亡和肥大中的作用,对于TRPM7在心肌肥厚及心衰中的作用的尚不明确。本研究先通过生信数据挖掘,提示心肌肥厚和凋亡有关,基于此研究TRPM7抑制剂香芹酚在心肌肥厚中的作用及其机制,旨为揭示心肌肥厚发病机制新靶点,为心肌肥厚治疗提供一定的理论与实践基础。方法:1、差异表达基因（DEGs）的鉴定我们从GEO数据库获得了心肌肥厚（HCM）样本的表达谱,所有的数据均在GPL1261平台上进行了分析。然后我们应用GEO2R比较正常健康组和HCM组,将p<0.05和|log FC|>1被设置为筛选标准,进行提取所选数据集中常见的上调表达或下调表达的差异基因。依据下载的平台注释文件,我们将矩阵文件中的原始探针级数据转换为gene symbol标准名。2、GO和KEGG Pathway分析将|log FC|>1和P value<0.05作为筛选标准进行筛选,进而将筛选完的差异基因呈递到DAVID数据库进行功能分析,得到GO和KEGG Pathway分析结果,根据结果绘制气泡图。3、蛋白-蛋白互作网络（PPI）的构建STRING数据库（https://string-db.org/）是一个用于存储有关已知蛋白和预测蛋白之间直接和间接相互作用信息的数据库。我们将凋亡相关基因上传到在线STRING数据库中以获得蛋白质相互作用信息,并构建蛋白-蛋白互作网络。4、Carvacrol与TRPM7蛋白分子对接本次对接的化合物香芹酚（carvacrol）通过Pubchem数据库下载得到的SDF格式。TRPM7晶体结构（PDB ID:6LZX,Resolution:3.10（?））从蛋白质数据库下载（https://www.rcsb.org）得到.。蛋白结构在分子操作环境（MOE 2019.1）平台进行处理,选用力场为OPLS-AA。选择MOE|dock模块,力场选择为OPLS-AA,蛋白设置为刚性,设置对接后产生构象为100个,利用London d G打分函数选取能量最负的构象。5、实验动物分组在本次研究中,分别将体重150±5 g的5组大鼠（n=8,雌雄各半）（8-10周）饲养在标准环境下。将所有大鼠在足够的食物和水的条件下以12小时的明/暗周期在受控温度下饲养。我们使用与先前研究完全一致的方法建立了HCM模型。对照组皮下注射生理盐水14天;模型HCM组、低剂量香芹酚组、高剂量香芹酚组和阳性药组皮下注射异丙肾上腺素（ISO）（5 mg/kg/天）,持续14天。14天后,我们将香芹酚溶解在丙二醇中进行腹腔注射。对照组和模型HCM组分别给予生理盐水和丙二醇14天。低剂量香芹酚组（25mg/kg/天）和高剂量香芹酚组（100mg/kg/天）分别给药14天。此外,普萘洛尔组给予普萘洛尔（12.5mg/kg）作为阳性药对照组。6、Real-time RT-PCR我们通过注射过量的水合氯醛杀死大鼠,然后收集大鼠的左心室用于进一步的RNA检测。我们使用不同的RT-PCR试剂和热循环条件在ABI 7500（Applied Biosystems,CA）上进行Real-time RT-PCR分析。当Ct值<35时,标本被视为阳性,用2-ΔΔ周期阈值（CT）法分析m RNA的相对表达水平。7、免疫印迹（Western Blot,WB）实验法使用RIPA缓冲液收集蛋白质样品,并在冰上孵育后超声处理。离心后,收集上清液用于BCA蛋白质定量,而后进行蛋白质印迹分析。蛋白质样品在SDS-PAGE胶上电泳并转移到PVDF膜上,然后将膜在含有一抗的TTBS中于4℃孵育过夜。在TTBS中洗涤几次后,将膜在二抗中于室温孵育2小时。使用ECL进行发光处理。通过使用Scion Image for Windows图像分析软件测量蛋白条带的光密度来评估蛋白表达水平。8、HE染色在脱蜡后,用苏木精溶液对5μm的纵向切片进行5min的染色,然后在1%的酸性乙醇（1%的HCl在70%的乙醇中）中浸入5μm,再用蒸馏水漂洗。然后将切片用曙红溶液染色3分钟,再用梯度酒精脱水并在二甲苯中澄清。然后,使用NIKON Eclipse ci和NIKON数字瞄准器DS-FI2对切片进行观察和拍照。9、统计分析统计数据表示为平均值±标准误。用Student’s t检验和单因素方差分析评估差异的统计显著性,然后进行Tukey检验（Graph Pad Software,San Diego,CA）进行评估,P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1、GEO2R差异基因分析我们在GEO数据库基于数据集GSE18801鉴定了其HCM组和正常组之间的差异基因。根据|log FC|>1并且p≤0.05的筛选标准,我们鉴定了761个差异基因,包括507个上调基因和254个下调基因。2、GO和KEGG生物途径及功能分析我们将这761个差异基因提交给DAVID数据库进行基因本体论（GO）富集分析,从三个结构化网络中识别了上调基因和下调基因的功能:分子功能,细胞成分和生物学过程。其中细胞成分涉及多个功能条目,例如细胞外空间,细胞外区域等;分子功能涉及多个方面,例如蛋白质结合,整联蛋白结合,蛋白质异二聚活性等。在生物学过程中,前20个最丰富的GO术语中有4个与细胞凋亡相关,因此我们将凋亡作为本次研究的重点。同时这些差异基因参与了多个KEGG通路,例如PI3K-Akt信号通路（32个基因）,HTLV-1感染（22个基因）,MAPK信号通路（22个基因）等。3、蛋白-蛋白互作网络确立以凋亡为研究对象后,我们将差异基因中凋亡相关蛋白提交到STRING数据库,得到蛋白蛋白互作网络,展示了DEGs中各个调控凋亡基因间的相互作用关系。4、凋亡相关蛋白质表达结果在动物实验中,我们通过蛋白质印迹法验证了HCM大鼠模型中与凋亡相关的Cleaved-Caspase 3,Bax和Bcl-2的蛋白表达水平。结果显示,与生理盐水组相比,Cleaved-Caspase 3的蛋白表达水平明显高于HCM组。同时,与HCM组相比,高剂量香芹酚显着降低了Cleaved-Caspase 3的蛋白表达。5、香芹酚对HCM大鼠模型TRPM7表达的影响。Real time RT-PCR的结果表明,与对照组相比,HCM组TRPM7的m RNA表达水平显着更高。同时,与HCM组相比,低剂量香芹酚和高剂量香芹酚均会降低TRPM7的m RNA表达水平。6、香芹酚对HCM大鼠心肌细胞形态学的影响。在HCM大鼠模型中,我们通过HE染色和Masson染色观察到大鼠心肌细胞出现明显的纤维化。同时,高剂量香芹酚改善了炎症细胞的浸润和心肌纤维化的范围。结论1、从Gene Expression Omnibus中分析了HCM的基因表达谱,并通过GO,KEGG和PPI鉴定了差异表达的基因,表明凋亡在HCM中至关重要。2、香芹酚降低HCM大鼠模型中Cleaved-Caspase 3的表达。3、香芹酚降低HCM大鼠模型TRPM7的m RNA表达。4、香芹酚延缓HCM大鼠心肌纤维化。综上所述,我们的研究表明香芹酚可以改善HCM心肌细胞凋亡和纤维化,为HCM提供有效的治疗候选药物和新的治疗靶点。