论文部分内容阅读
目的:缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)是星形胶质细胞上最主要的缝隙连接(gap junction,GJ)蛋白,能在细胞间传输毒性代谢产物和营养物质,对脑损伤的扩散和修复具有双向调节的作用。补阳还五汤具有补气养血,活血通络之功效,是中医治疗脑卒中后遗症的经典方剂。本实验主要通过行为学实验、高尔基染色与免疫荧光染色等技术,观察神经功能恢复情况、神经形态与血管新生的指标来探索在大鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)后的修复期中,Cx43在补阳还五汤促修复中的作用。血管的形成则是由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素因子 1(angiopoietin-1,Ang-1)调控决定,本实验对与之相关的作用机制进行了初步探索。这为补阳还五汤抗脑损伤机制中新靶点、新途径的研究提供了更多的实验依据。方法:运用线栓法给SD雄性大鼠建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,造模后将神经功能评分合格的大鼠随机分为模型组(MCAO),Cx43激动剂(GAP-134)组,Cx43抑制剂(Gap26)组,补阳还五汤(BYHWD)组和补阳还五汤联合Cx43抑制剂(BYHWD+Gap26)组,另设假手术对照组(Sham),每组12只大鼠。GAP-134药物剂量为3 mg/kg,灌胃,2次/d,Gap26给药剂量为25μg/kg,腹腔注射,1次/d(GAP-134与Gap26的给药时间均在造模后3d),补阳还五汤给药剂量为16g/kg,灌胃,2次/d(于造模后2h给药);模型组与假手术组用同样的给药方式,每次给予同等用量的生理盐水。1.Connexin43在补阳还五汤促进脑缺血再灌注后修复中的作用在术后第1,3,7 d对各组大鼠进行横木行走测试(Beam-walking test,BWT)以观测其运动整合和平衡协调能力,以及自发交替反应测试(Spontaneous alternation behavior test,SAB test)以观测其空间记忆能力。第7 d取各组大鼠脑组织,采用高尔基染色法观察海马CA1、CA3和DG区神经元基、顶树突的长度,节点数,终末分支数以及树突棘密度的改变以反映神经元树突的复杂性和树突棘的可塑性,激光共聚焦下观察并拍摄图片,Image-Pro Plus 6.0图片分析软件进行分析。2.Connexin43在补阳还五汤促进脑缺血再灌注后修复中的血管新生机制探究造模后第7 d,4%多聚甲醛灌注后取各组大鼠脑组织,采用免疫荧光法检测CD31表达量以计算海马CA1、CA3和DG区的微血管密度(microvessel density,MVD)以反映血管新生情况。并检测各分组海马CA1、CA3和DG区VEGFs和Ang-1蛋白阳性表达量。激光共聚焦下观察并拍摄图片,Image-Pro Plus 6.0图片分析软件进行分析。结果:1.与模型组比较,GAP-134组第7 d的评分降低(P<0.05),相对交替率显著提高(P<0.01),神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈增长的趋势,Gap26组第7d评分升高(P<0.05),相对交替率Gap26组有所下降(P<0.05),神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈下降的趋势,而BYHWD组大鼠衡木行走测试评分降低(P<0.05),自发交替反应测试相对交替率升高(P<0.05),神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈增长的趋势。相较于BYHWD组,BYHWD+Gap26组第7 d大鼠横木行走测试评分更高(P<0.05),自发交替反应测试相对交替率更低(P<0.05);神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈下降的趋势;。2.与模型组比较,GAP-134组海马三个区域MVD表达水平显著升高(P<0.01),Gap26组MVD值在CA1区、DG区表达降低(P<0.05),BYHWD组海马CA1、CA3和DG区MVD表达水平均升高(P<0.05)。与BYHWD组比较,BYHWD+Gap26组海马CA1、CA3和DG区MVD表达水平均显著降低(P<0.01)。与模型组比较,GAP-134组海马三个区域VEGF表达升高(P<0.01),CA3区Ang-1表达上调(P<0.05),Gap26组DG区VEGF表达下调(P<0.05),CA1区和DG区Ang-1显著下调(P<0.01),BYHWD组海马CA1、CA3和DG区VEGF表达升高(P<0.05),Ang-1 显著上调(P<0.01)。与 BYHWD 组比较,BYHWD+Gap26 组海马CA1和DG区VEGF显著下调(P<0.01),CA1区和CA3区Ang-1下调(P<0.05)。结论:1.脑缺血再灌注后,补阳还五汤可以通过星形胶质细胞Cx43介导改变树突的复杂性、促进神经功能恢复和血管新生以促进脑损伤的修复。2.补阳还五汤通过星形胶质细胞Cx43诱导血管新生的作用机制与VEGF,Ang-1有关。