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背景与目的肺癌是严重影响人类健康的恶性肿瘤,造成肺癌病人死亡的主要原因之一是肺癌的转移。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程是肺癌转移的重要机制之一,同时是促进肿瘤转移的重要步骤。因此探索细胞的EMT进程机制,将会为肺癌转移的治疗提供理论依据。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一类多功能细胞因子,是体外细胞EMT模型的经典诱导因子。NADPH氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 4,NADPH 4)是NOX家族里面的一个重要类型,其主要作用是产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。ROS可以作为第二信使促进细胞内一些信号通路的转导,进而调控细胞的增殖、凋亡、分化以及迁移等生物学行为。在乳腺癌细胞中,丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路介导了TGF-β诱导的细胞EMT进程。在人恶性胶质细胞瘤细胞中,TGF-β可以激活核转录因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路,进而促进EMT进程。在前期实验中,TGF-β诱导A549细胞EMT进程时,伴随着NOX4蛋白以及ROS水平的增加,并且促进细胞的迁移。那么,MAPK、NF-κB信号通路是否介导TGF-β诱导的A549细胞EMT进程?MAPK、NF-κB(p65)与NOX4在A549细胞EMT进程中有着怎样的关系?为了探索以上问题,本课题用TGF-β刺激A549细胞以构建EMT模型,然后分别用DPI、SB203580、BAY11-7082抑制NOX4、p38MAPK以及NF-κB(p65),观察对A549细胞EMT进程以及细胞增殖活性和迁移能力的影响。方法1、实验分组:(1)EMT模型的构建:根据TGF-β质量浓度分为:0.0μg/L组、1.0μg/L组、2.5μg/L组、5.0μg/L组、10.0μg/L组;(2)抑制NOX4表达时分为:空白组,TGF-β组,TGF-β+DPI组,DPI(NOX4抑制剂)组,DMSO(溶剂对照)组;(3)抑制p38MAPK表达时分为:空白组,TGF-β组,TGF-β+SB203580组,SB203580(p38MAPK抑制剂)组,DMSO(溶剂对照)组;(4)抑制NF-κB(p65)表达时分为:空白组,TGF-β组,TGF-β+BAY11-7082组,BAY11-7082(NF-κB(p65)抑制剂)组,DMSO(溶剂对照)组。2、蛋白的检测:Western Blot检测NOX4蛋白、EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白,信号通路蛋白p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)蛋白的表达。3、mRNA水平检测:Real-Time PCR检测NOX4 mRNA、p38MAPK mRNA、NF-κB(p65)mRNA的水平。4、ROS的检测:激光共聚焦显微镜定性观察ROS水平,流式细胞仪定量检测ROS的水平。5、细胞形态的观察:使用活细胞工作站对细胞进行拍照,观察其细胞形态的变化。6、迁移能力的检测:划痕实验检测细胞迁移能力,用photoshop软件对细胞划痕宽度进行分析,根据划痕宽度判断细胞迁移能力的改变。7、细胞增殖活性的检测:MTT细胞增殖活性检测试剂盒联合酶标仪检测细胞的增殖活性,根据不同组别吸光度的不同判断细胞的增殖活性。8、统计学分析:实验所得原始数据采取均数加减标准差表示(?x±s),数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析。5组分组的均数比较采取单因素方差分析(one-way ANOVA),各组数据的均数之间两两比较采用最小显著差法(LSD-t检验);2组分组的均数比较采取两独立样本t检验。检验水准α=0.05。结果1、在TGF-β浓度为5.0μg/L时,上皮细胞标志E-cadherin蛋白显著降低,间质细胞标志Vimentin蛋白和EMT进程转录因子Snail显著升高,并且NOX4蛋白和ROS水平升高(均P<0.001);因此,本研究选择5.0μg/L浓度的TGF-β进行后续实验。2、TGF-β刺激A549细胞后,与空白组相比,p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)的表达升高(均P<0.05)。3、TGF-β+DPI组与TGF-β组相比,NOX4 mRNA水平、NOX4、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、Vimentin、Snail蛋白表达降低,ROS水平下降,E-cadherin蛋白升高,(均P<0.001);MTT结果显示,TGF-β+DPI组与TGF-β组相比,细胞的增殖活性降低(P<0.001);划痕实验显示:TGF-β+DPI组与TGF-β组相比,细胞间划痕宽度变宽(P<0.001),说明其迁移能力降低。4、TGF-β+SB203580组与TGF-β组相比,p38MAPK mRNA水平、p38MAPK、p-p38MAPK、NOX4、Vimentin、Snail蛋白表达降低,ROS水平下降,E-cadherin蛋白升高(均P<0.001);与此同时,细胞的增殖活性和迁移能力均降低(均P<0.001)。5、TGF-β+BAY11-7082组与TGF-β组相比,NF-κB(p65)mRNA水平、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、NOX4、Vimentin、Snail蛋白表达降低,ROS水平下降,E-cadherin蛋白升高,(均P<0.001);细胞的增殖活性和迁移能力均降低(均P<0.001)。结论1、NOX4、p38MAPK、NF-κB(p65)可以介导A549细胞EMT进程,并且在TGF-β诱导A549细胞EMT进程中,NOX4与p38MAPK、NOX4与NF-κB(p65)之间相互影响,共同促进A549细胞EMT进程。2、用DPI、SB203580、BAY11-7082分别抑制NOX4、p38MAPK、NF-κB(p65)可以逆转由TGF-β诱导的EMT进程,并降低A549细胞的增殖活性和迁移能力。