尿素循环缺陷、雷尔氏综合征或肝功能衰竭引起的高氨血症可以导致多种精神和行为异常，如神志不清、健忘、烦躁和意识改变包括昏睡、嗜睡，晚期可以由脑水肿导致昏迷甚至是死亡。氨在肝性脑病中的致病作用在20世纪30年代就已经被确定，现在人们普遍接受特征性症状学由脑内氨浓度升高到3～5mM所致。我们以往的研究发现，氨慢性处理能增强培养的小鼠星形胶质细胞Na+，K+-ATP酶(NKA)的活性。主要与Na，K+-ATP酶α2亚基表达增加相关，氨依赖性的内源性哇巴因复合物生成增加，哇巴因与NKA结合，激活后续的Src，EGF受体，Raf, Ras，MEK和ERK1/2信号通路。ERK1/2的磷酸化诱导α基因表达上调。而且，这个信号通路结果与肾细胞系中低浓度哇巴因诱导的信号通路几乎相同。　　星形胶质细胞与其他非兴奋性神经细胞在形态和功能上高度不同，它们利用细胞内Ca2+和Na+浓度的动态波动完成它们的兴奋性。通过细胞内Ca2+释放的Ca2+通道，如InsP3受体（InsP3Rs）和兰尼碱受体(RyRs)调节内质网(ER) Ca2+的释放被认为是胶质细胞内Ca+信号的主要机制。ER内Ca2+持续释放，导致ER内Ca+耗竭，可以激活Ca2+池操纵性细胞膜Ca2+内流(store-operated plasmalemmal Ca2+entry，SOCE)，也被称为容量性Ca+内流(capacitative Ca2+ entry)。同时期的研究观点表明，SOCE可通过ORAI通道诱导钙释放激活的钙电流(ICRAC)或者通过细胞膜瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)阳离子通道来介导。星形胶质细胞SOCE主要和基本的组分由“经典”的TRP通道（“canonical”TRP channels）代表;其中TRPC1，4和5在星形胶质细胞表达。TRPC1亚基是通道的主要组分，因此负责通道的主要功能，而TRPC4/5是辅助亚基。用反义寡核苷酸敲除TRPC1或应用TRPC1阻断性抗体大大的降低星形胶质细胞SOCE。　　已经报道用5mM氨急性处理由于氨诱导细胞内碱化增加ER内Ca2+释放。然而，临床上很多药物慢性作用均能影响星形胶质细胞InsP3Rs诱导的ER内Ca+释放。最近，我们已经发现，由InsP3Rs和RyRs活化介导的ER内Ca2+释放和容量性Ca2+摄取，可以被选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀、抗双极抑郁药锂、卡马西平和丙戊酸抑制。已经证实，三种抗双极抑郁药均下调TRPC1基因的表达。　　星形胶质细胞表达多种神经递质受体，包括β1-肾上腺素能受体、Gs-偶联受体和α2-肾上腺素能受体、Gi/o型偶联受体。在星形胶质细胞激活这两种受体导致细胞内Ca2+浓度增加和表皮生长因子受体(EGFR)转激活。激活β1受体可以诱导PKA依赖性Gs/Gi转换，从而，导致细胞内储存Ca2+释放。然而，α2A肾上腺素能受体有效和特异性激动剂右旋美托咪啶，可以导致βγ亚基从Giα解离，而后者可以激活磷脂酶C。　　星形胶质细胞是肝性脑病主要的细胞基础，星形胶质细胞特异性的谷氨酰胺合成酶是中枢氨解毒作用的主要酶。脑氨水平增高的脑谷氨酰胺合成酶的活性增强可以影响星形胶质细胞主要的自身稳态功能，包括可以导致异常神经传递和脑水肿的K+、谷氨酸和水平衡;肝性脑病的基础可以认为是胶质细胞的病理毒理损害。本研究中，我们主要研究病理浓度的氨对星形胶质细胞内钙信号的影响。　　在本研究中，我们主要研究:①氨慢性处理对异丙肾上腺素和右旋美托咪啶诱导的Ca2+释放的影响;②氨慢性处理对InsP3Rs和RyRs诱导的Ca2+释放的影响;③氨慢性处理对SOCE的影响;④氨慢性处理对TRPC1 mRNA和蛋白表达的影响;⑤哇巴因抑制剂坎利酮对原代培养的星形胶质细胞氨诱导的TRPC1基因表达和SOCE的抑制作用;⑥注射尿素酶3天后的CD-1小鼠脑组织TRPC1 mRNA和蛋白质的表达;⑦注射尿素酶3天后特殊荧光标记的转基因小鼠新鲜分离的星形胶质细胞和神经元细胞TRPC1 mRNA的表达。　　方法:　　氯化铵慢性作用细胞3天，进行如下实验:①细胞用荧光探针染料Fura-2负载，奥林巴斯活细胞荧光显微镜下检测氯化铵慢性作用对β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素和α2-肾上腺素受体激动剂右旋美托咪啶刺激引起细胞内Ca2+增加的影响;②利用荧光探针技术，检测氯化铵慢性作用对RyRs激动剂4-CMC和InsP3Rs激动剂AdA刺激引起原代培养星形胶质细胞Ca2+增加的影响;③利用荧光探针技术，检测哇巴因抑制剂坎利酮对氯化铵慢性处理引起原代培养星形胶质细胞Ca+内流增加的影响;④用RT-PCR和免疫印迹方法检测哇巴因抑制剂坎利酮对氯化铵慢性处理原代培养星形胶质细胞TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表达的影响;⑤CD-1小鼠腹腔注射尿素酶3天建立高血氨模型后，用RT-PCR和免疫印迹方法检测尿素酶对脑组织TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表达的影响;⑥FVB/NTg(GFAP-GFP)14Mes/J或者B6.Cg-Tg(Thy1-YFPH)2Jrs/J转基因小鼠腹腔注射尿素酶3天建立高血氨模型后，取脑组织制备新鲜细胞悬液采用流式细胞仪分离星形胶质细胞和神经元细胞，用RT-PCR检测尿素酶对星形胶质细胞和神经元细胞TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表达的影响;使用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组资料用one-wayANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。　　实验结果:　　1、氯化铵慢性处理能够增强异丙肾上腺素和右旋美托咪啶刺激引起原代培养星形胶质细胞内Ca2+浓度增加的幅度　　β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素或者α-肾上腺素受体激动剂右旋美托咪啶刺激后能迅速引起细胞内Ca2+浓度的增加，氯化铵作用3天后的星形胶质细胞给予刺激后，细胞内Ca2+浓度增加幅度变大，且很快恢复正常，氯化铵能明显增加异丙肾上腺素或右旋美托咪啶刺激引起的细胞内Ca2+浓度增加的幅度。　　2、氯化铵慢性处理能够增强4-CMC、AdA刺激引起原代培养星形胶质细胞内Ca2+浓度增加的幅度　　RyRs的激动剂4-CMC或InsP3Rs的激动剂AdA刺激细胞后能够引起细胞内浓度的增加，氯化铵作用3天后能明显增加4-CMC或AdA刺激引起的细胞内Ca2+浓度增加的幅度，4-CMC作用缓慢而持久，AdA作用迅速而短暂，刺激后细胞内Ca2+浓度迅速增加。　　3、哇巴因抑制剂坎利酮对氯化铵慢性处理引起原代培养星形胶质细胞Ca2+内流增加的影响　　Thapsigargin是细胞内质网上Ca2+-ATP酶的抑制剂，将细胞加入Thapsigargin作用10 min，耗竭星形胶质细胞内储存的Ca2+，再重新加入CaCl2。细胞加入Thapsigargin刺激后，细胞内Ca2+浓度短暂增加，氯化铵对此作用没有影响。与正常对照组细胞相比，当加入CaCl2后，氯化铵慢性作用组星形胶质细胞内容量性Ca2+内流幅度增加25％，哇巴因抑制剂坎利酮能够明显抑制氯化铵慢性作用引起的细胞内容量性Ca2+内流的增加，使细胞内容量性Ca2+内流的增加幅度恢复到正常水平。　　4、氯化铵慢性作用上调原代培养星形胶质细胞TRPC1mRNA及TRPC1蛋白的表达，这一作用可以被哇巴因抑制剂坎利酮所抑制　　慢性氨作用引起的钙池操控性钙离子内流峰值的增加与氯化铵慢性处理3天引起特异性TRPC1蛋白和mRNA表达升高有关。原代培养星形胶质细胞应用氯化铵作用3天后浓度依赖性使TRPC1 mRNA及蛋白表达上调，而哇巴因抑制剂坎利酮能够明显抑制氯化铵慢性作用引起的TRPC1 mRNA及蛋白表达的上调。　　5、尿素酶慢性作用上调CD-1小鼠脑组织TRPC1 mRNA及TRPC1蛋白的表达　　腹腔注射尿素酶(33 units/kg/day)或者生理盐水作为对照组，尿素酶对在体脑组织TRPC1 mRNA及TRPC1蛋白表达的影响与氯化铵慢性处理原代培养的星形胶质细胞的作用相似，尿素酶作用3天能够上调脑组织TRPC1mRNA及TRPC1蛋白的表达。　　6、尿素酶慢性作用上调在体星形胶质细胞TRPC1 mRNA表达，但是对神经元细胞TRPC1 mRNA表达无影响　　腹腔注射尿素酶(33 units/kg/day)作用3天后，取脑组织制作悬液通过FACS分选获得新鲜星形胶质细胞和神经元细胞。尿素酶能够上调新鲜星形胶质细胞TRPC1 mRNA表达，在神经元细胞尿素酶没有作用。　　讨论　　星形胶质细胞谷氨酰胺合成酶的中枢作用和肝性脑病时星形胶质细胞相关的内稳态障碍已经获得了公认。而高氨血症时星形胶质细胞信号的病理性重塑机制仍未完全明了。本研究从体内及体外实验对高血氨模型的星形胶质细胞内Ca2+信号改变进行系统研究。我们特别研究了病理浓度的氨慢性处理对:①促代谢性受体诱导Ca2+释放的影响;②InsP3R和RyR激动剂诱导Ca2+释放的影响;③SOCE的影响;④体外实验TRPC1基因和蛋白表达的影响;⑤在体高血氨动物模型TRPC1基因和蛋白表达的影响。　　首先，我们发现在原代培养星形胶质细胞氨慢性处理（体外高血氨毒性模型）能够增强代谢性受体激活诱导的Ca2+信号。这是内质网Ca2+释放（内质网Ca2+释放是星形胶质细胞Ca2+信号的主要来源）增加的直接结果，因为氨慢性处理也能够增强直接刺激内质网Ca2+释放通道InsP3Rs和RyRs引起的Ca2+增加。这种钙离子增加的机制可能是由于内质网内Ca2+容量的增加，容量的增加可以增加Ca2+离子的电驱动性和使释放通道更容易开放，也可能是由于钙离子释放通道密度的增加，或者两者均有之。相关的机制仍需进一步进行研究。促代谢性受体激活诱发的Ca2+信号增加可以促进肝性脑病的病理进展，如可以增加囊泡谷氨酸的释放（氨急性作用促进星形胶质细胞谷氨酸的释放已经被证实）。　　其次，我们发现氨慢性作用能够显著增强星形胶质细胞SOCE。SOCE的增加主要反映TRPC1通道的表达增加，我们已经在体外细胞实验观察到了TRPC1基因和蛋白表达的增加。同样的结果我们也在注射尿素酶致氨损伤的小鼠脑组织发现。此外，TRPC1只在星形胶质细胞有增加，我们通过腹腔注射尿素酶的转基因小鼠分选出的新鲜细胞进行了实验。尿素酶的慢性作用只上调星形胶质细胞的TRPC1表达，而不影响神经元的TRPC1表达。　　星形胶质细胞SOCE主要由TRPC1，4，5通道介导，而在小胶质细胞则认为是STIM/ORAI复合物在起主要作用。我们实验室之前的研究证实特异性siRNA抑制TRPC1的表达、氟西汀慢性作用或抗双极抑郁药能够抑制原代培养星形胶质细胞的SOCE和激动剂诱导的Ca2+。TRPC1通道由于它们的渗透性在星形胶质细胞控制着几种溶质离子的信号，在生理条件下TRPC1允许Ca2+和Na+内流。Na+内流可以产生溶质Na+信号，这个信号可以控制和调整负责胶质细胞内稳态功能的很多分子，例如包括:K+缓冲，神经递质的释放和神经元的代谢支持，这些对氨诱导的肝性脑病具有重要作用。TRPC1表达的上调和SOCE的增加可以被哇巴因抑制剂坎利酮完全抑制，我们之前的实验也证实了坎利酮能够抑制氨诱导的胶质细胞水肿。坎利酮的作用由哇巴因/Na, K-ATPase/Src/EGFR/PI3K-AKT/ERK1/2信号通路介导，这条信号通路似乎与氨依赖的细胞病理学有关。这条通路能够调整影响肝性脑病的几种基因的表达，如葡萄糖转运蛋白GLUT-1，水通道蛋白4和GFAP，成为肝性脑病治疗干预的重要靶点。另一个相关性的治疗策略与抗抑郁有关，如选择性5羟色胺再吸收抑制剂氟西汀、抗精神病药锂、卡马西平和丙戊酸均已经被发现能够减少星形胶质细胞内质网Ca+库来源的Ca2+信号，而且下调TRPC1的表达。　　结论:　　病理浓度的氨可以增强异丙肾上腺素、右旋美托咪啶、AdA、4-CMC刺激引起的星形胶质细胞细胞内Ca+的增加的幅度。氨诱导的星形胶质细胞TRPC1mRNA及TRPC1蛋白表达的上调作用可以被哇巴因抑制剂坎利酮抑制。哇巴因样物质在肝性脑病发病中起重要作用。