目的前期研究表明,P糖蛋白(mdr1,abcb1b 具有调节胰岛素分泌的生物功能,它通过与氯离子通道蛋白3(ClC-3)、钙离子通道蛋白的相互作用,影响胰岛素颗粒酸化和释放。本研究通过细胞分子生物学手段对这一假说进行初步验证。方法(1)经胆管不离体灌注胶原酶V消化分离的Wistar大鼠胰岛。(2)体外培养大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1。(3)针对P糖蛋白的特异序列(abcb1b)设计寡核苷酸序列,通过siRNA干扰技术下调胰岛与INS-1细胞中P糖蛋白的表达,应用荧光显微镜、定量PCR和Western blot分别测定转染效率、目的基因表达量与蛋白表达量的变化。(4)进行siRNA干扰和钙离子通道阻滞剂干预后,应用共聚焦显微镜+钙染色、全细胞膜片钳技术观察钙内流的变化,应用PTI成像技术观察胰岛素颗粒酸碱度的变化,应用全细胞膜片钳技术观察胰岛素分泌的变化,应用荧光显微镜观察细胞凋亡的变化。(5)环孢菌素A干预后,应用罗丹明123实验测定P糖蛋白外排泵功能的变化。(6)应用不同的糖浓度和不同的胰岛素浓度干预INS-1细胞,应用定量PCR检测细胞中abcb1b mRNA表达的变化,应用Western Blot检测细胞中P糖蛋白表达的变化,应用罗丹明123实验测定P糖蛋白的外排泵功能的变化。结果(1)siRNA干扰48小时后,荧光显微镜下观察可见90%的胰岛与INS-1细胞分别呈红色(胰岛)与绿色(INS-1细胞)荧光,表明转染成功;定量PCR证明siRNA下调了 P糖蛋白基因abcb1b mRNA的表达:Western blot提示P糖蛋白的表达量下调。(2)共聚焦显微镜+钙染色探测到胰岛beta细胞P糖蛋白表达的下调导致了细胞内钙离子浓度下降;膜片钳探测到钙电流随着P糖蛋白表达量的下调而减少;P糖蛋白下调后的胰岛beta细胞对L型钙通道阻滞剂依拉地平的反应几乎消失;PTI成像技术观察到随着P糖蛋白表达量下调,胰岛颗粒pH值增高;膜片钳探测P糖蛋白表达下调后胰岛素两相分泌均受损;荧光显微镜观察可知P糖蛋白表达的下调没有对细胞凋亡造成明显影响。(3)环孢菌素A干预24小时后,罗丹明123实验测定的P糖蛋白功能显著下降,但是P糖蛋白的表达没有变化。(4)高浓度葡萄糖(16.7、22.2mmol/l)组abcb1b mRNA的表达量下降,并且随干预时间延长abcb1b mRNA的表达有进一步下降的趋势。葡萄糖浓度为5.6mmol/l的实验组中,随着胰岛素浓度的增加,abcb1b mRNA的表达量也下降,并且随干预时间的延长进一步下降;反之,葡萄糖浓度为11.1mmol/l的实验组,随着胰岛素浓度的升高,abcb1b mRNA的表达逐渐升高,并且随干预时间的延长而进一步增加;Western blot在葡萄糖干预组与mRNA水平变化相似,但各胰岛素干预组间差异无统计学意义;罗丹明123实验显示,随着葡萄糖浓度的升高,INS-1细胞中P糖蛋白功能下降;葡萄糖浓度为5.6mmol/l和11.1mmol/l的干预组中,P糖蛋白外排泵功能有随着培养基中胰岛素浓度增加而升高的趋势,但是没有统计学意义。结论(1)P糖蛋白表达下调减少了细胞中钙离子的内流,这一调节作用与L型钙通道相关;P糖蛋白表达下调减低了胰岛素颗粒的酸化;P糖蛋白表达下调使胰岛素两相分泌均受损;P糖蛋白表达变化与细胞凋亡之间未发现显著相关性,以上结果初步证明了 P糖蛋白的表达和功能很可能与胰岛细胞钙离子内流以及胰岛素颗粒酸碱度的变化相关,但是本研究缺乏P糖蛋白、L型钙离子通道蛋白和ClC-3相互作用的直接证据,需进一步探索。(2)环孢菌素A干预导致胰岛beta细胞中P糖蛋白外排泵功能显著下降,结合环孢菌素A干预胰岛后造成的胰岛素第二相分泌的异常,可以假设环孢菌素A影响胰岛素分泌的机制可能涉及了 P糖蛋白调节胰岛素颗粒酸化的过程(酸化是调节胰岛素颗粒第二时相释放的重要环节)。(3)高糖显著抑制胰岛beta细胞中P糖蛋白的表达与功能;胰岛素对abcb1b mRNA水平表达的影响则取决于外环境中葡萄糖的浓度,并且对P糖蛋白蛋白与功能水平的影响并不显著。虽然其中的分子机制还有待于进一步研究,但是我们可以进一步从P糖蛋白的表达与功能随着血糖以及胰岛素的变化而变化的现象中推测,P糖蛋白在糖尿病发病机制中应该占有一席之地。