新霉素(NEO)是由新霉素链霉菌产生的一种氨基糖苷类抗生素,在兽医上被广泛用于治疗畜禽细菌性感染。新霉素抗菌谱广,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。新霉素对人和动物有潜在的耳毒性和肾毒性,为确保食品安全,有必要对其在动物性食品中的残留情况进行监测。本研究应用EDC法将NEO分别与KLH、BSA、OVA偶联,紫外吸收法测得其蛋白浓度分别为2.39、2.12、3.13 mg/mL。以偶联产物二次免疫小鼠后,小鼠血清效价达1：3200,并在竞争试验中表现出良好的阻断情况。由此可见,NEO与蛋白质偶联成功。应用NEO-KLH和NEO-BSA作为免疫原,NEO-OVA作为检测原,应用单克隆抗体技术获得3株ELISA效价高的单克隆细胞株,分别命名为11B5、3B1、10H7。运用辛酸饱和硫酸铵法和Protein G Resin对各株单克隆抗体进行纯化,并对其特性进行鉴定。间接竞争ELISA结果表明,11B5株单克隆抗体IC50为2ng/mL,3B1株单克隆抗体IC50为6ng/mL,10H7株单克隆抗体IC50为18ng/mL,三株单克隆抗体均属IgG1亚类。应用11B5株单克隆抗体包被酶标板,配合NEO-HRP建立直接竞争ELISA法,方阵试验确定抗体工作浓度为1：800,NEO-HRP工作浓度为1：16000。直接竞争ELISA确立标准曲线,本方法线性范围是0.5～7.5ng/mL。其R2达0.9949,IC50=1.645ng/mL。通过检测大量牛奶空白样品,确立LOD和LDM分别为7.12和29.2ng/mL。在牛奶样品中分别添加终浓度为10、50、100ng/mL NEO标准品,通过直接竞争ELISA检测并结合标准曲线得出其回收率分别为80.51±12.38%、87.00±7.73%、68.73±2.25%,变异系数分别为10.41%、8.88%、3.27%。从以上数据可以看出,当添加终浓度为50ng/mL时,回收情况最为理想,当添加终浓度为100ng/mL时,方法的稳定性较好。直接竞争ELISA法测定其与多种氨基糖苷类抗生素的交叉反应性,结果表明：此抗新霉素单克隆抗体具有较好的特异性,与其他氨基糖苷类抗生素交叉反应均小于0.01%。