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大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）是一类重要的植物病原真菌,它能侵染200多种植物,且寄主范围仍在不断扩大。近年来,由该病菌引起的黄栌枯萎病在北京香山等地严重发生,造成大量的黄栌枯萎死亡,严重损害了香山等地的红叶景观并造成巨大的经济损失。大丽轮枝菌在其病害循环后期能够形成一种休眠结构,即微菌核。微菌核会随着植物残体进入到土壤内,并在土壤内存活长达十几年。一旦遇到合适的寄主植物,微菌核又能萌发形成菌丝,进而侵染植物。因此,微菌核在大丽轮枝菌的整个病害循环过程中发挥着重要的作用,而它也是导致该病害难以防治的一个重要原因。目前,对于大丽轮枝菌微菌核形成的分子调控机制并不十分明确,而近年来大丽轮枝菌全基因组序列的公布和遗传转化体系的逐步完善,加速了大丽轮枝菌微菌核形成和致病相关基因的发掘和功能研究,为从基因组水平解析大丽轮枝菌微菌核形成和致病过程的分子机制提供了新的平台。本论文通过mRNA-Seq的方法对大丽轮枝菌微菌核形成过程进行了转录组分析,并通过基因敲除的方法对筛选得到的可能参与微菌核形成的1个C2H2转录因子基因、2个bZIP转录因子基因和1个MADS-box转录因子基因进行了深入的功能研究,研究结果如下:1.明确了微菌核形成过程中的基因表达及代谢途径的变化:通过显微镜观察,明确了大丽轮枝菌从分生孢子（CO）到成熟微菌核过程中的细胞学变化,并确定了微菌核形成的4个关键阶段用于转录组分析,包括微菌核形成前期（MSl-60h）、微菌核形成初期（MS2-72h）、微菌核形成中期（MS3-96h）和微菌核成熟期（MS4-14d）。转录组测序分析发现从CO阶段到MS4阶段,表达的基因数从9412个逐渐增加到9939个,并从中筛选得到724个基因在微菌核形成的4个阶段中都显著差异表达,其中600个基因显著上调表达,124个基因显著下调表达。基因功能注释和富集分析发现,这些上调表达的基因参与了氧化还原、黑色素合成、蛋白质分解、碳水化合代谢等多种细胞学过程。此外,分析发现不同大丽轮枝菌菌株的Lineage-Specific（LS）区域序列差异明显,另外在各阶段中鉴定到大量以内含子保留形式为主的可变剪切事件。2.筛选得到一些可能具有重要功能的大丽轮枝菌C2H2转录因子基因:利用生物信息学的方法,在大丽轮枝菌基因组中鉴定到79个C2H2转录因子基因,并发现一个扩张的C2H2-Homeobox亚家族。基因数字表达谱分析发现,有36个C2H2转录因子基因在微菌核形成阶段显著上调表达,22个C2H2转录因子基因在营养缺乏条件（缺碳或缺氮）显著上调表达,11个C2H2转录因子基因在模拟维管束营养条件下显著诱导表达。进一步分析发现,5个C2H2转录因子基因（VDAG03208、VDAG03437、VDAG05960、VDAG07359和VDAG08766）在微菌核形成、营养缺乏和模拟维管束营养条件下都显著上调表达,这表明它们可能影响大丽轮枝菌微菌核形成、营养代谢和致病性等过程。3.大丽轮枝菌C2H2转录因子基因VdCrzl（VDAG03208）参与调控微菌核形成和致病性:从大丽轮枝菌基因表达数据库中筛选到一个可能具有重要功能的C2H2转录因子基因VDAG03208。生物信息学分析发现,该基因是酿酒酵母中Crzl的直系同源基因,命名为VdCrzl。荧光定量PCR和启动子融合绿色荧光蛋白（GFP）分析发现,VdCrzl在微菌核形成初期及模拟维管束营养条件下上调表达。利用基因敲除的方法对VdCrzl进行生物学功能分析发现,缺失VdCrzl导致大丽轮枝菌微菌核形成显著减少,并造成该病菌对黄栌幼苗的致病性明显降低。同时发现,敲除VdCrzl使得该病菌对高浓度Ca2+胁迫的抗性显著降低,但并不影响该病菌的菌丝生长和分生孢子产生。亚细胞定位分析发现,Ca2+刺激使得VdCrzl从细胞质转移到细胞核内。上述结果表明VdCrzl在大丽轮枝菌微菌核形成、致病性和Ca2+胁迫响应中发挥着重要的作用。4.大丽轮枝菌bZIP转录因子基因VDAG08640和VDAG08676未参与微菌核形成,但共同调控了氧化胁迫应答过程:从微菌核形成过程的转录组数据库中筛选到2个显著差异表达的bZIP转录因子基因VDAG08640和VDAG08676,其中VDAG08640在微菌核形成过程中显著上调表达,而VDAG08676在微菌核形成过程中下调表达。生物信息学分析发现,VDAG08676为Atfl的直系同源基因并普遍存在于不同真菌中,而仅在少部分真菌中发现了 VDAG08640的同源基因。对这两个基因进行生物学功能分析发现,敲除VDAG08640或VDAG08676并不影响该病菌微菌核的形成,且VDAG08640敲除突变体在菌丝生长、产孢、压力胁迫响应和致病性表型上与野生型菌株无明显差异;而敲除VDAG08676导致该病菌的孢子产量和致病性显著降低。对VDAG08640和VDAG08676进行双基因敲除分析发现,双敲除突变体依然能够形成与野生型菌株相似的微菌核,但对双氧水胁迫表现更为敏感。5.大丽轮枝菌MADS-box转录因子基因VdMcml是重要的微菌核形成调控因子和致病因子:从大丽轮枝菌基因表达数据库中筛选到一个MADS-box转录因子基因VdMcml,该基因在微菌核阶段显著上调表达。对该基因进行敲除分析发现,敲除突变体在菌丝生长、分生孢子产生、孢子形态、细胞壁内几丁质含量和致病性等方面出现了明显的表型缺陷。利用GFP表达菌株WT-GFP和△VdMcml-GFP对根部侵染过程进行观察发现,敲除VdMcml导致该病菌分生孢子不能正常地附着在植物根部表面;进一步分析发现,敲除VdMcml会导致该病菌分生孢子的粘附力显著降低。此外,敲除VdMcml导致该病菌的微菌核形成显著减少。对野生型和VdMcml敲除突变体在微菌核形成14d进行基因数字表达谱分析发现,上百个基因在VdMcml敲除突变体中显著下调表达,它们参与多种不同的代谢途径。深入分析发现,以VDAG07928为核心骨干基因的整个次生代谢基因簇（VDAG07920-VDAG07931,共12个基因）在VdMcml敲除突变体中都显著下调表达,而该基因簇内的大部分基因在微菌核形成过程中显著上调表达。这些结果表明大丽轮枝菌MADS-box转录因子基因VdMcml参与调控该病菌的生长、产孢、细胞壁完整性、致病性和微菌核形成等过程。