背景与目的：肺癌是当今全球范围内危害性最大的疾病之一,在各类恶性肿瘤引起的死亡中高居榜首。肺癌主要分小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类,统计表明,85%的肺癌为非小细胞肺癌,非小细胞肺癌中约40%为肺腺癌。肺癌的发生与多种机体内外因素有关,EGFR、k-Ras、c-Myc、p53、DOK等多种癌基因或抑癌基因的突变或表达异常被发现在肺癌的发生中起关键作用。虽然EGFR激酶抑制剂、单克隆抗体药物、新的化疗药物的出现、放疗技术的进步、手术方式的改进等已经使肺癌治疗取得很大的进步,但整体预后仍然较差,其中非小细胞肺癌患者的五年存活率仅为16%左右,而小细胞肺癌患者的存活率则更低。数十年来肺癌的致死率居高不下,其主要原因是由于缺乏有效的早期诊断方法和显著延长晚期患者生存期的治疗手段。在所有的肺腺癌中,约有50%的患者表皮生长因子(Epidermal growth factor receptor, EGFR)过表达。EGFR是介导细胞生长信号的重要分子,主要通过激酶磷酸化导致的下游信号分子激活和细胞核内化后作用于功能基因发挥调节细胞生长的作用,与肺癌的发生、发展和预后明显相关,已成为肺癌治疗的最重要靶点,多种针对EGFR的靶向治疗药物如吉非替尼、厄罗替尼、西妥昔单抗等已被批准用于肺癌临床治疗。吉非替尼/厄罗替尼对携带EGFR基因外显子19或21突变的肺癌患者有着很高的治疗有效率,对不伴EGFR基因外显子19或21突变的肺癌虽然仍有少部分病例有效,但整体疗效较差。EGFR基因突变的患者只占肺腺癌患者的很少部分,因此大部分患者仍不能获得很好的病情缓解,需要寻找新的治疗靶点和方法,以提高肺癌治疗的有效率。因此,对EGFR信号通路调控机理的进一步研究,以期发现EGFR信号调节的新机制,获得新的肺癌治疗靶点,提高肺癌的治疗效果,具有非常重要的意义。原发性肝癌在肿瘤引起的死亡中居于第五位,其中超过50%的原发性肝癌发生在中国,是危害我国人民身体健康的重要疾病。原发性肝癌的发生主要由于肝炎病毒感染、慢性酒精刺激和其它毒性物质等导致的肝组织慢性损伤、异常修复,进而出现肝纤维化,最后导致肝癌。研究表明,损伤导致的肝脏炎性修复在肝癌的发生中起关键作用,NFκB/IL-6/STAT3信号通路在损伤修复和肝癌形成过程中发挥重要功能。肝癌是死亡率最高的肿瘤之一,其根本原因是早期发现困难、进展期治疗手段缺乏。最近几年来,分子靶向治疗已经在肝癌的治疗中取得一定效果,但是生存期延长很有限,需要进一步的机制研究,发现新的肝癌发病机理和治疗靶点。TIP30是本博士论文作者的导师Xiao Hua等在研究人类免疫缺陷病毒的体外转录时发现的一种分子量30KD的Tat(Transactivator of transcription)结合蛋白(Tat interactive protain, TIP30),又称HTATIP2(HIV-1 Tat interactive protein 2),其作为HIV转录的辅助因子可以和Tat相互结合特异性地提高HIV增殖。后来的序列分析发现TIP30蛋白与同期报道的肿瘤转移抑制基因CC3表达的蛋白为同一蛋白。研究认为TIP30基因主要通过调节与细胞增殖、凋亡及血管生成相关基因而达到抑制肿瘤转移的作用。但最近的研究发现TIP30除参与调节基因转录外,还具有调节DNA损伤修复、影响细胞对葡萄糖的耐受性、调控胞浆内信号分子运输等多项功能。TIP30研究已进入一个新的、快速发展的时期,相关研究容易取得突破性的成果,并有助于我们探索肺癌发病的新机理、确定TIP30能否成为肿瘤治疗的新靶点,具有非常重要的意义。现有的研究已经证明TIP30与肺癌的转移明显相关,并能抑制体外生长的肺癌细胞的增殖。同时有报道在小鼠混合品系的背景下,Tgp30基因敲除能导致小鼠自发性肝癌出现,并且约37%的人原发性肝癌TIP30表达下调,考虑TIP30在肝癌的发生中具有重要作用。但目前有关TIP30与肺癌、肝癌发生和转归的相关的直接证据很少,更缺乏相关作用机制的报道。在纯合背景条件下,Tip30基因敲除是否仍然能导致自发性肝癌出现,Tip30基因敲除和肺癌发生的关系等,都未见报道。本研究拟在Balb/c或FBV纯合背景条件下,研究Tip30基因敲除和肺癌、肝癌发生的关系及其相关机制,同时对现有基因芯片数据库中的病例资料进行分析,了解TIP30与人体肺癌的预后和治疗敏感性的关系,进一步确定TIP30在肿瘤发生和预后判断中的作用。方法：1.实验动物饲养和处理：将Tip30基因敲除的C57J6小鼠与野生型Balb/c或FBV小鼠(Tip30+/+小鼠)杂交,得到Tip30基因敲除的Balb/c或FBV小鼠,连续传代7代以上,最后获得Balb/c或FBV纯合背景的Tip30基因敲除小鼠(Tip30-/-小鼠)。连续观察18个月,记录疾病、死亡和肿瘤形成的情况,满18个月后处死小鼠,进行相关研究。2.组织学检查：小鼠全部肺、肝、脾、乳腺详细解剖后,常规10%福尔马林固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋。最后组织切片,HE染色,邀请两位病理专家分别阅片,记录肿瘤发生和其它异常的组织改变。3.免疫组化检测：按照Cell Signaling公司所给的操作步骤进行。切取3-4μm厚的组织切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精再水化,醋酸钠溶液和微波加热抗原修复,过氧化氢中和组织中过氧化氢酶,5%BSA封闭,加一抗后摄氏4度过夜。第二天加亲合素结合的二抗,ABC溶液孵育,DAB染色,苏木精复染细胞核,永久封闭液封片,光学显微镜下观察。4.免疫荧光/激光共聚焦检测：组织免疫荧光检测：跟免疫组化一样,进行切片、脱蜡、水化、抗原修复、封闭,然后加一抗过夜。第二天加相关荧光素标记的二抗,室温孵育1小时后冲洗,0.2%的苏丹黑去除组织自发荧光,加DAPI进行细胞核染色,盖玻片覆盖后荧光显微镜下观察。体外培养细胞免疫荧光/激光共聚焦检测：细胞爬片,不同处理因素处理后不同时间点,4%多聚甲醛固定,0.1% Triton-100透膜,5%BSA封闭,然后加一抗摄氏4度过夜。第二天加相关荧光素标记的二抗,室温孵育1小时后冲洗,加DAPI进行细胞核染色,盖玻片覆盖后激光共聚焦显微镜下观察。5.免疫印迹检测：组织/细胞蛋白提取：剪取适量组织,加入RIPA裂解液(含1mM DTT和蛋白酶抑制剂),剪碎组织(培养细胞搅动均匀),摄氏4度裂解20分钟,13000RPM离心10分钟,测定上清蛋白浓度,加合适体积的上样液,煮沸变性。细胞核/细胞浆蛋白萃取：按照试剂盒生产公司提供的说明书进行(Millipore公司),分离的细胞核和细胞浆蛋白加合适体积的上样液,煮沸变性。检测：蛋白溶液经SDS电泳、转膜,5%BSA封闭,β-actin作总蛋白的内参,Lamin B做细胞核蛋白内参,β-tubulin作为细胞浆蛋白的内参,加一抗后摄氏4度过夜。第二天加二抗,孵育45分钟后漂洗,Odyssey成像系统扫描成像,Odyssey2.1软件分析图像。6.基因转染：利用已有质粒,制备慢病毒质粒,转染细胞,puromycin筛选,转染后的细胞经免疫印迹证实转染效果。7.细胞凋亡检测：利用TUNEL方法检测细胞凋亡,按照TUNEL试剂盒生产厂家提供的说明书进行操作(Roche公司),每个切片随机计数5个视野的凋亡细胞数。8.CCK8方法进行体外细胞抑制实验：细胞生长于96孔板,按照实验设计的不同分组和不同时间,在需检测的培养孔中加入10μ1 CCK-8溶液,37度孵育1小时后测定OD值(584nm)。9.荧光定量PCR检测：从肝组织中用Qiagen RNA试剂盒提取RNA,用Invitrogen公司的oligodT、dNTP、ReversetranscriptaseⅢ将mRNA逆转录成cDNA,用Biorad公司的SybrGreen qPCR试剂盒做qPCR,用RNA polymeraseⅡ做内参。小鼠SP-1上游引物为TCCATGGATGAAGTGACAGCTG,下游引物为TGGGAGTTGTTGCTGTTCTCAT小鼠IL-6上游引物为AGAGGAGACTTC AC AGAGGAT,下游引物为TACTCC AGGTAGCTATGGTAC.用Biorad iQ5仪器运行PCR。95℃预变性3分钟,95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒,连续40个循环。样本表达量计算：表达量=2-(Ct(样品)-Ct(内参))。10.基因芯片数据库分析：选取目前为止最大的一个公开发表的含有442例肺腺癌的基因芯片数据库为分析对象,取数据库中所有的三组TIP30数值的平均值作为TIP30的最终值。计算TIP30中位值,将TIP30大于或等于中位值的患者计入TIP30高表达组,小于中位值的患者计入低表达组。分别分析两组指之间的术后生存时间、复发时间、复发后生存时间,并绘制生存曲线,比较两组之间的差异。11.统计学分析：实验结果以均数±标准差(x±s)表示,采用双尾双样本等方差t检验分析各分子在两组小鼠中的表达差异,x2检验分析两组小鼠之间的肿瘤发病率差异,Log-rank (mantel-cox)检验分析生存曲线之间的差异。应用Excel2003软件进行双尾双样本等方差t检验分析,Graphpad prism 5进行x2检验分析和Log-rank (mantel-cox)检验分析,P<0.05为有统计学意义。结果：1.Tip30基因敲除可导致Balb/c小鼠自发性肺肿瘤出现：观察18个月后,全部51只Tip30-/-的Balb/c小鼠中,绝大部分伴有肺泡上皮增生,不伴气管／支气管上皮增生,其中43.2%(22/51)的Tip30-/-小鼠发现有自发性肺肿瘤,显著高于Tip30+/小鼠的8.3%(1/12)和的Tip3+/+小鼠的4.2%(1/24),P<0.05。2.Tip30基因敲除导致的自发性肺肿瘤具有显著的特点：组织学观察发现,Tip30基因敲除导致的自发性肺肿瘤均为肺腺瘤(10/51)或肺腺癌(12/51),位于肺的外周部位。免疫组化分析发现全部自发性肺肿瘤Ⅱ型肺泡上皮细胞标志SP-C阳性,支气管上皮Clara细胞的标志CC10阴性,提示肿瘤来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞。3.Tip30基因启动子主要在Ⅱ型肺泡上皮细胞中激活：免疫荧光双染色发现β-Gal在SP-C阳性细胞(Ⅱ型肺泡上皮细胞)中高表达,而基本不在CC10阳性细胞中表达。因为在Tip30基因敲除时,保留了Tip30基因的启动子,在原Tip30基因位点插入β-Gal基因,因此以上结果提示Tip30可能在Ⅱ型肺泡上皮细胞中高表达,在支气管上皮Clara细胞中低表达。4.Tip30基因敲除上调细支气管-肺泡结合部位的肺上皮干细胞/祖细胞数目：细支气管肺泡结合部位的SP-C、CC10双阳性细胞被多个研究结果证明有肺上皮干细胞或祖细胞功能。免疫荧光双染色发现,Tip30-/-小鼠细支气管-肺泡结合部位的SP-C、CC10双阳性细胞(肺上皮干细胞/祖细胞)数目显著多于Tip30+/+小鼠,P<0.05。5.Tip30基因敲除可通过促进Ⅱ型肺泡上皮增殖,进而导致小鼠自发性肺肿瘤发生：免疫组化检查发现Tip30-/-小鼠肺泡每高倍视野内Ⅱ型肺泡上皮细胞数目显著高于Tip3+/+小鼠,P<0.05。免疫荧光双染色发现Tip30-/-小鼠SP-C阳性的Ⅱ型肺泡上皮细胞中,PCNA阳性表达细胞显著多于Tip3+/+小鼠,P<0.05。而Tip30-/-小鼠和Tip30+/+小鼠肺泡细胞中的凋亡细胞数无显著性差异,P>0.05。提示Tip30基因敲除主要是通过促进Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖,而不是通过抑制细胞凋亡,导致小鼠自发性肺肿瘤出现。6.Tip30基因敲除通过上调EGFR表达、激活EGFR下游信号分子Akt、Erk来促进肺上皮细胞增殖：免疫荧光检查Tip30基因敲除导致的自发性肺肿瘤均为EGFR阳性肿瘤,Tip30-/-小鼠肺泡内EGFR阳性细胞数显著多于Tip30+/+小鼠,P<0.05。免疫组化证实Tip30-/-小鼠肺泡和肿瘤内EGFR下游信号分子pAkt、pErk和cyclin D1表达的显著上调,P<0.05。免疫印迹分析也证实Tip30-/-小鼠肺组织内pAkt、pErk表达的显著高于Tip3+/+小鼠,P<0.05。7.TIP30基因抑制可延长EGF诱导的人肺腺癌细胞EGFR下游信号分子AKT、ERK1/2的活化时间：免疫印迹分析发现,EGF诱导后2小时,TIP基因抑制的肺腺癌A549细胞(TIP30-SH1)pAKT水平显著高于TIP30对照细胞(shRNA-CON), P<0.05。EGF诱导后8小时,TIP30-SH1细胞pERK1/2水平显著高于shRNA-CON细胞,P<0.05。8.TIP30基因抑制通过干扰早期内涵体环节的EGFR转运,进而抑制EGFR降解：免疫荧光/激光共聚焦检测发现,EGF处理后,EGFR在TIP30基因抑制的肺癌细胞A549细胞的EEA1阳性的早期内涵体内滞留,使EGFR不能顺利分选到溶酶体内降解。免疫印迹分析发现EGF诱导后8小时,TIP30-SH1细胞EGFR水平显著高于shRNA-CON细胞,P<0.05,提示TIP30基因抑制的肺腺癌A549细胞EGFR降解明显受抑制。9.TIP30基因抑制可促进EGF诱导的EGFR核内化：EGF诱导后2小时,免疫荧光/激光共聚焦检测发现TIP30基因抑制的A549细胞EGFR核内化显著增加。EGF诱导后3小时,免疫印迹检查发现TIP30-SH1细胞核内EGFR水平显著高于shRNA-CON细胞,P<0.05。提示TIP30可抑制EGF诱导的EGFR细胞核内化。10.EGF可诱导TIP30核内化：EGF诱导后,免疫荧光/激光共聚焦检测发现TIP30本身也可出现明显的核内化。提示EGF诱导的EGFR信号通路激活可能是调节TIP30核内化的重要机制。11.TIP30低表达的早期肺腺癌患者具有更长的术后生存时间：应用Kaplan-Meier生存曲线分析,对目前已发表的、最大的一个含有442例肺腺癌的基因芯片数据库的分析,发现TIP30表达低于中位值的早期(Ⅰ/Ⅱ期)肺腺癌患者术后总生存时间显著长于TIP30高表达的患者,P<0.05。12.TIP30低表达的肺腺癌患者病情进展后存活的时间更长：对手术后复发的早期肺腺癌患者分析发现,TIP30表达低于中位值的患者,复发后生存时间显著长于TIP30高表达的患者,P<0.05,中位肿瘤复发到死亡的时间为19.0个月,显著长于TIP30高表达的患者(7.5个月)。13.TIP30表达水平与EGFR激酶抑制剂敏感性相关：体外细胞抑制实验发现,EGFR激酶抑制剂吉非替尼或MEK/ERK抑制剂U0126作用5天后,对TIP30-SHl细胞的抑制率显著高于shRNA-CON细胞,P<0.05。提示TIP30基因抑制后,人肺腺癌A549细胞对EGFR激酶抑制剂吉非替尼或MEK/ERK抑制剂U0126更敏感。14.纯合背景下,Tip30基因敲除不会导致小鼠自发性肝肿瘤出现：51只Balb/c纯合背景和32只FBV纯合背景的Tip30基因敲除的小鼠均未见有自发性肝肿瘤出现。不同于以往报道的杂合背景下Tip30基因敲除可导致自发性肝肿瘤出现。15.Tip30基因敲除可抑制DEN诱导的肝肿瘤发生：5mg/Kg体重的亚硝基二乙胺(Diethylnitrosamine, DEN)腹腔注射后8个月,Tip30+/+雄性FBV小鼠肝癌发病率为90.9%(10/11),而同期13只Tip30-/-雄性FBV小鼠均未发现肝癌(0/13),两组之间有显著性差异,P<0.05。16.Tip30基因敲除可抑制DEN诱导的小鼠肝纤维化：100mg每公斤体重DEN处理6天或5mg每公斤体重8个月后,免疫组化和免疫印迹检查均发现,Tip30-小鼠肝内a-SMA表达显著少于Tip30+/+小鼠,P<0.05。提示Tip30基因敲除可抑制DEN处理导致的肝纤维化。17.Tip30基因敲除可抑制肝组织增生和肝细胞增生：100mg每公斤体重DEN处理后6天,Tip30-小鼠肝脏占体重的百分比显著低于Tip30+/+小鼠,P<0.05。DEN处理后3天,免疫组化检查发现,Tip30-/-小鼠肝内细胞增殖性抗原PCNA阳性细胞数显著少于Tip30+/+小鼠,P<0.05。免疫印迹检查也发现Tip30-/-小鼠肝内PCNA表达水平显著低于Tip30+/+小鼠,P<0.05。18.Tip30基因敲除对DEN处理导致的小鼠肝细胞凋亡无明显影响：100mg每公斤体重DEN处理后4小时或5mg每公斤体重DEN处理后8个月,Tip30-/-小鼠肝内凋亡细胞数目稍多于Tip30+/+小鼠,但两者之间的差异没有显著性,P>0.05。19.Tip30基因敲除可抑制肝细胞细胞周期蛋白cyclin D1表达：100mg每公斤体重DEN处理3天或5mg每公斤体重8个月后,免疫组化检查发现,Tip30-/-小鼠肝内cyclin D1阳性细胞数显著少于Tip30+/+小鼠,P<0.05。免疫印迹检查也发现Tip30-/-小鼠肝内cyclin D1表达水平显著低于Tip30+/+小鼠,P<0.05。20.Tip30基因敲除可抑制STAT3的激活：DEN处理后,免疫印迹检查发现,Tip30-/-小鼠肝内pSTAT3表达低于Tip30+/+小鼠,两者之间的差异具有显著性,P<0.05。21.Tip30基因敲除可下调DEN处理导致的IL-6转录和翻译：100mg/公斤体重DEN处理后4小时,荧光定量PCR检测发现Tip30-/-小鼠肝内IL-6 mRNA显著低于Tip30+/+小鼠,P<0.05。DEN处理后24小时后,ELISA检测发现Tip30-/-小鼠血清IL-6蛋白水平显著低于Tip30+/+小鼠,P<0.05。22.Tip30基因敲除可抑制DEN处理后的NFKB磷酸化：100mg/公斤体重DEN处理后24小时,Tip30-/-小鼠肝内pNFκB表达低于Tip30+/+小鼠,两者之间的差异具有显著性,P<0.05。23.Tip30基因敲除可抑制DEN处理后的IKB降解：100mg/公斤体重DEN处理后24小时,Tip30-/-小鼠肝内IκB表达高于Tip30+/+小鼠,两者之间的差异具有显著性,P<0.05。提示DEN处理后导致的Tip30-/-小鼠肝内IκB降解显著被抑制。24.Tip30基因敲除可抑制DEN肝损伤导致的巨噬细胞肝内浸润：免疫组化分析发现,100mg每公斤体重DEN处理72小时后,或5mg每公斤体重8个月后,Tip30-/-小鼠肝内MAC-2阳性巨噬细胞数明显少于Tip30+/+小鼠,两者之间的差异具有显著性,P<0.05。25.Tip30基因启动子主要在巨噬细胞中激活：免疫荧光双染色发现p-Gal在肝MAC-2阳性细胞(枯否氏细胞)中高表达。因为在Tip30基因敲除时,保留了Tip30基因的启动子,在原Tip30基因位点插入β-Gal基因,以上结果提示Tip30在枯否氏细胞中高表达。26.Tip30基因敲除可下调DEN处理导致的SP-1转录和翻译：100mg每公斤体重DEN处理后4小时,荧光定量PCR检测发现Tip30-/-小鼠肝内SP-1 mRNA显著低于Tip30+/+/小鼠,P<0.05。27.Tip30基因敲除不影响DEN处理后小鼠肝细胞EGFR下游信号分子活性：100mg每公斤体重DEN处理后72小时,免疫印迹检查发现,Tip30-/-小鼠肝内pAkt、pErk表达与Tip30+/+小鼠比较无显著性差异,P>0.05。结论：1.本研究结果证明TIP30可能是一个多功能蛋白,可作用于不同的信号通路和细胞部位,在不同的组织和不同的细胞中发挥不同的作用。TIP30对肺癌的发生具有抑制作用,对DEN损伤导致肝肿瘤发生具有促进作用。2.本研究获得了一个特别的肺癌动物模型：所有Tip30基因敲除导致的小鼠自发性肺肿瘤均为肺腺瘤或肺腺癌,位于肺的外周部位,都来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞,伴有EGFR表达和EGFR下游信号通路激活。本模型是目前唯一的伴有EGFR表达上调和EGFR下游信号通路激活、但不伴EGFR基因突变的动物模型,为EGFR及其下游信号通路作用机理研究和相关靶向药物研究提供了一个新的、理想的动物模型；3.本研究初步探明TIP30抑制肺癌发生的机理：证明Tip30基因敲除可通过上调EGFR表达、使EGFR下游信号分子激活、增加肺上皮干细胞/祖细胞的数目、促进肺泡II型上皮细胞增殖,最终导致来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞的小鼠自发性肺腺癌出现。4.TIP30基因抑制可干扰EGFR自内涵体向溶酶体的分选,抑制EGF诱导的EGFR降解,导致EGFR下游信号分子激活时间延长,进而促进肺癌细胞生长。5.TIP30基因抑制可促进EGF诱导的EGFR细胞核内化,加速cyclin D1的表达,进而促进肺癌细胞生长。EGF处理后,TIP30本身也可发生核内化。6.本研究的结果提示TIP30表达水平可作为早期肺腺癌的预后判断指标：TIP30表达下调的早期肺腺癌患者术后生存期更长,手术切除复发后的生存时间也更长。7.TIP30基因抑制的肺腺癌细胞对EGFR激酶抑制剂吉非替尼更敏感,TIP30可能EGFR激酶抑制剂吉非替尼的疗效预测指标。8.纯合背景下,Tip30基因敲除不能导致小鼠自发肝肿瘤出现,同时Tip30基因敲除可抑制强诱癌剂DEN诱导的自发性肝肿瘤出现。9.Tip30基因敲除可通过抑制DEN导致的IκB降解、下调NFκB/IL-6/STAT3信号通路活性,抑制DEN处理后的肝细胞损伤、修复和纤维增生,进而抑制DEN诱导的肝癌形成。10.Tip30基因敲除还可通过下调SP-1表达,抑制DEN处理导致的肝细胞损伤后巨噬细胞肝内浸润,进而阻碍DEN处理导致的肝纤维化和肝癌形成。