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一、研究背景我国是世界上肝炎性肝癌最严重的地区之一,临床上我们希望切除更多病变肝脏,但伴随而来的致命性的肝功能衰竭问题尤为严重[1],这就成为了一项难题。虽然肝移植是一种有效的治疗途径,但供体的严重不足限制了肝移植的应用,而有效刺激自身肝再生便是解决这些问题的理想途径[2]。新近研究发现,跨膜泛素样蛋白1(Tmub1)是一种能够在肝再生过程中发挥重要负性调控作用的蛋白[3]。既往课题组对于Tmub1的研究多集中于下游,而对于转录后调控阶段并没有太多涉及。探讨Tmub1蛋白与其上级调控因子之间的作用,能够帮助我们更深一层的去解释肝再生的相关机制。mi RNA作为一种重要的在转录后调控水平对目的蛋白进行上游调控的因子[4],在现阶段越来越受到重视。我们通过生物信息学发现,在Tmub1 m RNA的3’非编码区序列中存在mi R-27a/b潜在的结合位点,所以,我们推测miR-27a/b能够与Tmub1 m RNA结合并影响Tmub1蛋白表达水平,进而在肝再生过程中发挥调控肝细胞增殖的作用。研究肝再生过程中mi R-27a/b与Tmub1表达的关系,能够为进一步阐明肝再生分子调控网络提供新的参考资料,对临床上治疗及预防肝功能衰竭有积极的指导意义。二、研究目的通过检测mi R-27a和mi R-27b两个亚型及Tmub1在大鼠肝切除术后不同时间段的表达情况,分析mi R-27a/b与Tmub1的表达相关性,从而明确在肝再生过程中mi R-27a/b在Tmub1基因表达调控中的作用。三、材料和方法1.选取SD雄性大鼠40只,体重在160-200g,随机分为肝部分切除术组(PH group、实验组)和剖腹探查组(sham group、假手术组)。并依次提取肝部分切除术后0h、12h、24h、48h、72h的肝组织及原代肝细胞。2.采用mi RNA分析软件Target Scan和micro RNA.org对Tmub1基因进行生物信息学分析。3.利用Real-time PCR检测术后不同时间段各组肝组织内mi R-27a/b两个亚型与Tmub1 m RNA的量,并利用western blot技术检测术后不同时间段各组肝组织内Tmub1蛋白量,从而分析出miR-27a/b两个不同的亚型与Tmub1表达的时间相关性。并利用荧光素酶报告基因技术,分析mi R-27a/b与Tmub1 m RNA的结合活性。四、结果1.生物信息学检测结果:Tmub1基因3’UTR序列中存在一处miR-27a/b潜在结合位点,同时我们运用反向分析法分析mi R-27a/b后发现,Tmub1同样是miR-27a及mi R-27b的目的基因。2.Real-time PCR实验结果提示,通过与假手术组比较发现,肝切除术后12h、24h、48h、72h,mi R-27a/b表达有不同程度的下降(P<0.05),而在0h表达无明显差异(P>0.05)。同时我们检测PH组及假手术组术后Tmub1 mRNA不同时间段的表达情况,发现在PH术后12h、24h、48h、72h,Tmub1 mRNA的量较假手术组明显升高(P<0.05)。且mi R-27a/b及Tmub1 mRNA的量在术后24h及48h改变最为明显。3.western blot表明,正常肝细胞中Tmub1微量表达,PH术后12h,大鼠肝细胞中的Tmub1蛋白表达开始增加,且于术后48h达高峰,与假手术组相比,肝部分切除术组在术后(12h、24h、48h、72h)的Tmub1表达量均明显升高(P<0.05),而肝部分切除术组术后0hTmub1蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。4.荧光素酶报告基因检测结果提示:mi R-27a/b模拟物与Tmub1报告基因载体共转染组的荧光素酶活性明显下降,且mi R-27b的作用更为明显,提示miR-27a/b两个亚型都可以与Tmub1基因结合发挥表达调控作用。五、结论本研究发现,miR-27a和miR-27b两个亚型均可以负向调控Tmub1的表达,而且mi R-27b的作用稍强。因此miR-27a/b可以通过参与Tmub1基因的表达调控过程来影响肝细胞的增殖,进而调控肝再生的过程。