DNA甲基化是一种重要的表观修饰,有一定的保守性。在植物中,DNA甲基化能够稳定地遗传,同时也有组织特异性以及发育阶段特异性。相关研究发现,植物细胞在不同组织分化后基因组DNA甲基化经常会发生一定变化。然而,植物细胞在分化或脱分化过程中基因组DNA甲基化的变化规律及其对基因表达影响等方面的研究非常有限,而且不同植物基因组DNA甲基化的式样有一定的物种特异性,这些物种特异性在细胞分化或脱分化过程中对基因表达是否有影响一直缺乏关注。本实验以典型的油料种子植物蓖麻为实验材料,以胚和胚诱导愈伤为材料进行转录组全基因组DNA甲基化的高通量测序,以期探索蓖麻组培过程中DNA甲基化的改变模式,及其对基因表达的调控。这不但增加了对不同植物组织DNA甲基化发生的多样性认识,而且对理解DNA甲基化产生的生物学功能具有重要的参考意义。主要研究结果如下:1为了获得蓖麻胚愈伤组织,我们首先优化蓖麻胚愈伤组织的培养体系,设置不同浓度梯度的萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid,NAA)和噻重氮苯基脲(Thidiazuron,TDZ),蓖麻胚愈伤诱导结果表明当6-苄氨基腺嗓(6-Benzylaminopurine,6-BA)和NAA的浓度分别为2mg/L和0.3 mg/L时,蓖麻胚愈伤组织状态最佳。将切除胚根和子叶的胚于诱导愈伤组织的培养基上,切口处逐渐膨胀,一个月后有愈伤组织的产生,愈伤率有90%以上。愈伤生长较好,外观呈现出浅黄色的硬颗粒或小块状,可以作为后续的测序材料。2为了探究蓖麻胚和愈伤组织DNA甲基化的变化规律,我们进行全基因组DNA甲基化测序,结果呈现CHH类型甲基化比例达到50%以上,而CG和CHG类型甲基化占比相对较少,说明蓖麻胚和胚愈伤组织CHH甲基化是主要形式。CG甲基化在基因body区明显高于上下游2 kb区域,而CHG和CHH则相反。对胚和胚愈伤组织进行差异甲基化分析,共得到差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs)35287个,其中,CGDMR1349个,CHGDMR608个,而CHHDMR33330个。在CHHDMR中,99.8%的DMR是由胚愈伤组织的低甲基化所导致的。总之,在蓖麻胚愈伤组织的培养过程中,DNA甲基化整体上呈现出下降的趋势。3为了调查蓖麻胚和愈伤组织在基因表达上的差异,我们开展了转录组测序,共获得18274个基因,其中在胚和胚愈伤中共表达的基因有14563个,仅在胚中表达基因有1998个,仅在愈伤组织中特异表达的有1713个。进一步分析获得11704个差异显著的表达基因,其中大部分基因(10626个)在愈伤组织中表达上调,仅一小部分(1078个)基因表达下调。在这些差异表达基因中,我们鉴别了 19个可能参与愈伤组织形成的差异表达基因,其中有6个基因参与细胞周期调控机制,6个基因与激素相关,参与损伤诱导的基因3个,参与胚胎命运再获的有4个。4为了调查DNA甲基化是否对基因表达的调控有影响,我们开展了差异表达基因和DNA甲基化的关联分析,发现表达水平与甲基化程度相关联的基因4363个。同时,我们在这些关联基因中,鉴别了4个参与愈伤组织形成关键基因,表达水平和DNA甲基化显著负相关。对于CG DMRs,发生在genebody区域和down2k时,能够显著提高基因的表达水平,而发生在promotor区域差异基因的表达不受影响。当CHG DMRs和CHH DMRs发生在基因body区域时,能够显著提高基因的表达水平;而当DMRs发生在promotor和down2k时,差异表达基因的表达不受影响。这些结果反映了胚愈伤组织基因组DNA的低甲基化和基因的表达呈显著的负相关。总之,该研究调查了蓖麻胚和脱分化后的胚愈伤组织基因表达差异和DNA甲基化变化情况。并对DNA甲基化和差异基因进行关联分析,发现蓖麻胚愈伤组织中,DNA甲基化全面降低,同时关联基因的表达明显升高,在基因组水平呈显著负相关。