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研究背景:植物中的黄酮类物质具有抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡等作用,因此大多数的学者认为黄酮类物质能够保护心肌细胞对抗心肌缺血再灌注造成的损伤。但是最新的研究发现,一些黄酮类化合物在特定的条件下也对心肌细胞产生了一些不利影响,这有可能加重心肌细胞在缺血再灌注状态下的损伤。不过黄酮类化合物对心肌细胞造成不利影响的机制尚不明确。目前已知黄酮类化合物能激活细胞中芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,Ahr),Ahr能够影响细胞内多条信号通路,进而能够发挥多种生理或病理功能。我们推测黄酮类化合物在激活Ahr后可能产生了一些对心肌细胞在缺血再灌注条件下不利的影响。目的:本实验选用槲皮黄酮和β-萘黄酮来处理在缺血再灌注状态下的心肌细胞,一方面考察这些黄酮类物质是否具有对心肌细胞的保护作用,另一方面研究了这些黄酮类物质对Ahr下游的信号分子的影响,探究这些信号分子是否介导了黄酮类物质对心肌细胞产生的不利影响。实验方法:为了构建了心肌H9c2细胞缺血再灌注模型,我们将该细胞在缺氧缺糖的条件下(0.5%的氧气浓度,无糖培养基)培养24小时,模拟心肌细胞的缺血状态,然后将该细胞转移至正常含糖培养基中在正常氧浓度条件下继续培养24小时,模拟心肌恢复供血。在药物添加组中,心肌H9c2细胞在缺血再灌注状态下用槲皮黄酮或是β-萘黄酮处理48小时。然后利用流式细胞仪、乳酸脱氢酶和细胞中caspase-3蛋白水平检测来评估心肌细胞的损伤;通过测定心肌细胞中自由基(Reactive oxygen species,ROS)和抗氧化能力来评估心肌细胞的氧化还原状态;免疫组化,免疫共沉淀和Western blot检测用来研究槲皮黄酮或是β-萘黄酮对Ahr下游的信号分子的影响。结果:在心肌H9c2细胞缺血再灌注模型中,细胞中caspase-3蛋白水平升高,凋亡率明显增加,培养基中乳酸脱氢酶浓度上升,这都说明缺血再灌注对心肌细胞造成严重损伤,诱导细胞凋亡,但是添加槲皮黄酮和β-萘黄酮能够保护心肌细胞,防止细胞死亡。心肌H9c2细胞缺血再灌注模型中,细胞中ROS的水平明显升高,抗氧化能力下降。槲皮黄酮和β-萘黄酮抑制细胞中ROS的产生,增强了细胞的抗氧化能力。通过免疫组化,免疫共沉淀和Western blot检测我们发现槲皮黄酮和β-萘黄酮激活了 Ahr,使其转移进入细胞核内与Ahr细胞核转运蛋白(Ahr nuclear translocator,ARNT)结合,从而抑制低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)与 ARNT 结合,使得 HIF-1α促进一氧化氮和血管内皮生长因子产生的能力减弱。基因敲除心肌细胞中Ahr,恢复了 HIF-1α与ARNT的结合,以及一氧化氮和血管内皮生长因子的产生。结论:本实验表明槲皮黄酮和β-萘黄酮在心肌细胞缺血再灌注的情况下既有对心肌细胞有利的一面——防止自由基的产生和抑制细胞凋亡,同时也有不利的一面——抑制HIF-1α产生一氧化氮和血管内皮生长因子的功能。